Что такое биосенсорные устройства?

 

Биосенсоры представляют собой прекрасный пример «продукта», создаваемого с применением новейшей биотехнологии. Создание биосенсоров относится к области междисциплинарных исследований и отражает появление союза биологии, химии, физики и микроэлектроники.

Последние 20 лет отмечены интенсивным развитием исследований в области биосенсорных устройств. Несмотря на то, что специалисты все еще не пришли к единому мнению, что называть биосенсором – аналитическую систему для работы с биологическим веществом или систему, содержащую биологическое вещество, больше данных в пользу определения, согласно которому биосенсором называется аналитическая система, содержащая биологический материал (ферменты, клетки, антитела, антигены, рецепторы, фрагменты ДНК), который находится в непосредственном контакте или встроен в физико-химический датчик. В биосенсорных устройствах используются физико-химические преобразователи различных типов; оптические, акустические, кондуктометрические, калориметрические, электрохимические. Тип датчика определяется особенностью реакций и превращений в биологическом тестирующем элементе биосенсора, и невозможно найти какой-либо один, универсальный преобразователь на все случаи анализа. Тем не менее некоторая иерархия к настоящему времени установилась и можно отметить, что большая часть биосенсорных устройств, как коммерчески доступных, так и описанных в исследовательских работах, основана на электрохимических преобразователях (например, электроде Кларка) и оптических датчиках.

Наряду с указанным определением биосенсорными устройствами именуются и электронные, оптические или электронно-оптические элементы, содержащие компонент биологической системы. Причем этот элемент предназначен для работы именно в электронном или элетронно-оптическом устройстве. Например, светочувствительные биосенсоры – это устройства, содержащие в качестве рабочего материала те или иные фоточувствительные биологические структуры (макромолекулы, фоторецепторные мембраны и т. д.) и предназначенные для регистрации, преобразования и хранения оптической информации. Отправной точкой и стимулом к разработке таких сенсоров служат данные о высокой квантовой эффективности, чувствительности и широком динамическом диапазоне природных светочувствительных систем, принимающих участие в таких процессах, как зрение, фотосинтез и др.

В дальнейшем мы будем рассматривать биосенсорные устройства лишь как аналитические системы. Обобщенная конструктивная схема известных типов биосенсоров представлена на рис. 2. Схема иллюстрирует основную концепцию (идею) биосенсоров: биологические компоненты «трансформируют» свою активность в электрический ток. Пользуясь этой концепцией, можно представить, что существуют два основных типа биосенсоров.

Первый тип – биоаффинные биосенсоры. В этом случае молекулы биополимера, образующие чувствительный элемент, «узнают» молекулы вещества, находящиеся в анализируемом растворе. В результате взаимодействия между этими молекулами (комплексообразования) свойства молекул биодатчика (цвет, форма и т. д.) меняются. Такое изменение свойств представляет собой «сигнал» для системы, причем величина «сигнала» должна быть пропорциональна концентрации исследуемого вещества.

Второй тип – фермент-метаболитные биосенсоры. В этом случае молекулы фермента, образующие чувствительный элемент, «узнают» молекулы субстрата, присутствующего в растворе. Продукт реакции, появляющийся в результате взаимодействия фермент-субстрат, пред-

ставляет собой «сигнал» для системы, причем величина «сигнала» должна быть пропорциональна концентрации анализируемого субстрата.

Важнейшим элементом любого биосенсора является биологический чувствительный элемент (биоспецифическая поверхность, биодатчик, тест-объект. В целях унификации терминов в дальнейшем изложении материала будет употребляться последний термин – тест-объект). Можно сказать, что тест-объект – это ансамбль биологических молекул, который отражает свойства исследуемой среды в виде характерного «сигнала». Специфичность тест-объекта определяется эффективностью реакции «узнавания». К преимуществам биосенсоров относятся:

1. Достаточно высокая специфичность анализа, что исключает предварительную обработку исследуемых образцов;

2. Возможность анализа малых объемов образцов в сочетании с быстротой проведения определения;

3. Возможность контроля за результатами анализа по типу обратной связи, что достигается за счет совместимости биосенсоров с микропроцессорами;

4. Отсутствие требований к высокой квалификации персонала, проводящего анализ, что обусловлено простотой самого анализа;

5. Относительно низкая стоимость биодатчиков.

С 1974 г., т. е. со времени появления первого коммерческого биосенсора, интерес к биосенсорным устройствам постоянно растет. С экономической точки зрения, биосенсоры ещене являются частью «большого бизнеса». Биосенсорные устройства используются в различных отраслях науки и промышленности. Хотя точное определение быстро растущего рынка биосенсоров затруднительно, имеются некоторые оценки рынка биосенсоров на 1990 г. по четырем наиболее важным направлениям потребления биосенсоров: медицина – 200 млн долларов, ветеринария и сельское хозяйство – 105 млн долларов, охрана окружающей среды – 67 млн долларов, мониторинг промышленных процессов – 59 млн долларов.

Рассматривая схему, приведенную на рис. 2, можно сказать, что конструирование биосенсоров сводится, по существу, к решению двух задач, относящихся к разным областям науки. Во-первых, это создание такого тест-объекта, в котором реакция «узнавания» используется с максимальной эффективностью. Такая задача решается в рамках биологических наук. Во-вторых, это создание адекватной схемы регистрации появляющегося в системе сигнала. Эту задачу решают в рамках технических наук. Теоретически любая молекула или биохимическая реакция могут быть использованы для создания биодатчиков. Анализ литературных данных показывает, однако, что большая часть коммерчески доступных в настоящее время биосенсоров создана на основе иммобилизованных белков (ферментов, антител и т.п.) или клеток бактерий. Что же касается работ, описывающих применение

молекул других биополимеров для создания биосенсорных устройств, в частности молекул нуклеиновых кислот, то число таких работ ограничено.

 

 

Подходы к классификации

Биосенсорных устройств

 

Ранее указывалось, что не возможно представить ни универсальный биологический тестирующий элемент, ни физико-химический датчик, пригодные на все случаи. Поэтому конструкции биосенсорных устройств в значительной степени различаются. В связи с этим классификация биосенсоров весьма затруднительна. Укажем основные подходы к решению этой проблемы.

Прежде всего, коснемся вопроса конструктивной особенности биосенсорного устройства по взаимному расположению биологического тестирующего элемента и датчика, регистрирующего состояние тест-объекта. В классической схеме эти две компоненты непосредственно связаны. Однако существует компоновка биосенсорных устройств, где биологический аналитический узел и измерительная система разделены. Это биосенсоры реакторного типа. Устройство состоит из следующих главных частей: узлов транспорта, смешивания и термостатирования анализируемых растворов и реагентов, аналитического узла на основе иммобилизованных тест-объектов и измерительной системы (рис. 3). Определение метаболитов происходит при непрерывном потоке раствора. Известны также упрощенные варианты систем, в которых узлы транспорта и смешивания растворов отсутствуют или аналитический узел с измерительной системой смонтированы в одном блоке. В упрощенных системах биокатализатор захватывается на магнитной мешалке или отделяется от измерителя полупроницаемой мембраной. Все эти системы различаются по принципу действия и инструментальному оформлению.

В анализаторах этого типа применяются ковалентно пришитые ферменты. Наиболее часто в качестве носителя используется пористое стекло. В первых аналитических системах использовались включенные в акриламидный гель глюкозооксидаза и лактатдегидрогеназа. Первые автоматические системы на основе колоночных мини-реакторов появились в 70-е гг. Концентрация продуктов определялась спектрофотометрическим способом по образованию окрашенных соединений.

 

Рис. 3. Структурная схема автоматической аналитической системы на основе мини-реактора: 1 – автоматический пробоотборник; 2 – перистальтический насос; 3 – термостат; 4 – отделитель воздушных прослоек; 5 – аналитический мини-реак-тор; 6 – измеритель; 7 – блок управления; 8 – усилитель; 9 – самописец. а – каналы транспортировки пробы; б – воздух; в – буферный раствор; г, д – сток раствора

 

Глюкозный анализатор на основе мини-реактора прост в изготовлении и обладает высокой точностью в интервале концентраций углевода от 10^-4 до 2,3×10^-2 М. В течение 10-дневного периода наблюдается небольшое увеличение чувствительности прибора. Заменой глюкозооксидазы другими ферментами, продукты которых определяются стандартным образом, можно расширить диапазон определяемых субстратов.

В некоторых работах аналитические системы реакторного типа не относятся к биосенсорным устройствам. Однако указанные системы обладают практически всеми признаками биосенсорных устройств. Более того, возможен анализ проб с помощью этих систем в двух режимах: статическом и динамическом. Первый режим предполагает проведение биохимического процесса в мини-реакторе «до конца», а определение содержания анализируемого вещества основывается на анализе количества продукта на выходе из реактора; этот режим незаменим при проведении анализа веществ, содержащихся в микроколичествах в малых объемах проб. Работа во втором режиме основана на определении скорости биохимической реакции. Аналитическое определение содержания того или иного вещества предполагает поддержание постоянной скорости протока и температуры пробы в мини-реакторе и калибровку аналитической системы по стандартным растворам.

Наиболее распространены в настоящее время подходы к классификации биосенсоров, основанные на определении типа биологической компоненты или физико-химического датчика («биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов», «электрохимические», «оптические», «акустические» биосенсоры и т. д.). Иногда в классификационном обозначении присутствуют типы как биологического, так и физико-химического элементов (например, «ферментный электрод»). В других вариантах называется тип электронного или оптического устройства, на основе которого осуществляется передача сигнала к анализатору («ионоселективный полевой транзистор», «люминесцентный волоконнооптический датчик» и т. д.). По мере роста производства биосенсоров классификация их будет совершенствоваться, при этом определяющее значение, возможно, будут иметь и наименования первых или наиболее крупных производителей.

 

 

Тест-объект биосенсора

 

Основным компонентом биосенсорного устройства является биологический чувствительный элемент. Именно по его реакции на действие определяемого вещества, по тем процессам, которые протекают в присутствии анализируемых соединений на нем, и производится качественный или количественный анализ пробы среды. Благодаря вполне определенным свойствам этого компонента биосенсорного устройства обеспечивается высокая чувствительность аналитической системы, селективность и точность измерений.

Среди названий биологических тестирующих элементов, приводимых в работах, посвященных биосенсорам, можно встретить такие, как биоспецифическая поверхность, биодатчик или некоторые другие. Но, как указано в разделе 1.2, с целью унификации терминов в процессе изложения материала этот элемент будет именоваться тест-объектом.

В качестве тест-объекта биосенсорного устройства могут быть использованы различные компоненты биологических систем – ферменты, антитела, антигены, нуклеиновые кислоты, рецепторы, клеточные органеллы, клетки, ткани, отдельные живые организмы и др. Однако любой из указанных компонентов сам по себе еще не является тест-объектом биосенсорного устройства. Дело в том, что молекулярные компоненты клетки могут растворяться в среде, подвергаться процессам биологической и химической деструкции, инактивироваться и т. д.; для живых организмов характерны процессы адаптации, сенсибилизации или какие-либо другие, которые в конечном итоге могут привести к искажению их реакции на воздействие анализируемой среды. Для того чтобы выбранный нами компонент живого организма (или сам организм) стал полноценным элементом биосенсорного устройства, необходима дополнительная его обработка, обеспечивающая работоспособность биологического компонента в устройстве. Суть процедур дополнительной обработки биологических компонентов выбирается в каждом конкретном случае отдельно, но существует и ряд практически универсальных способов такого рода манипуляций (например, иммобилизация), которые будут обсуждены далее.

Таким образом, определим тест-объект биосенсорного устройства как компонент аналитической системы биологического происхождения, обработанный специальным образом с целью обеспечения работоспособности, высокой чувствительности и селективности, а также долговечности биосенсора.

Тест-объект биосенсорного устройства должен удовлетворять ряду требований, главными из которых являются: 1) доступность; 2) относительно невысокая стоимость; 3) безопасность в эксплуатации (следует упомянуть, что в качестве тест-объекта могут быть использованы бактерии и нуклеиновые кислоты, кроме того, биосенсор может применяться, например, для анализа компонентов воды в сети водоснабжения или работающего биореактора; в этих условиях указанное требование приобретает особую актуальность); 4) тест-объект должен быть селективен по отношению к определяемому веществу (или группе веществ); 5) должен обеспечивать воспроизводимость результатов анализа; 6) должен быть работоспособным в заданном диапазоне параметров среды (температура, давление, влажность, рН, ионная сила и т. п.). Указанный список требований отнюдь не полный, и в каждом конкретном случае могут быть оговорены и другие требования.

Названным требованиям в той или иной мере отвечают все те упомянутые ранее биологические компоненты (ферменты, антитела, рецепторы и др.), применяемые в биосенсорных устройствах. Следует, однако, отметить, что идеальный вариант, т. е. биологический тестирующий элемент, полностью удовлетворяющий хотя бы указанным требованиям, подобрать практически невозможно. Поэтому реально выбирается оптимальный вариант. Вероятно, последнее частично и объясняет наличие значительного разнообразия тест-объектов даже в однотипных конструкциях биосенсорных устройств, предназначенных для определения содержания какого-либо определенного вещества.

 

Ферменты как тест-объект

Биосенсорного устройства

 

Ферменты – это наиболее популярные тест-объекты биосенсорных устройств. Достаточно упомянуть, что первые биосенсоры (ферментные электроды для определения содержания глюкозы) представляли собой конструкции на основе ферментов. Да и первые промышленно выпускаемые биосенсоры (и большинство ныне известных промышленно производимых биосенсорных устройств) тоже изготавливались на основе ферментов. В настоящее время известны работы по синтезу некоторых ферментов. Однако эти процедуры достаточно сложны и дорогостоящи. Поэтому сейчас реальны и наиболее распространены методики выделения ферментов из биологических объектов.

В живых организмах постоянно происходят самые разнообразные химические реакции. При фотосинтезе, дыхании, усвоении питательных веществ, в процессе синтеза и распада белков, жиров, углеводов, витаминов и других соединений мы постоянно встречаемся со сложнейшими реакциями, лишь с трудом воспроизводимыми вне организма. Между тем в биосистемах эти реакции протекают очень легко и с высокой скоростью. Большое различие в скоростях реакций внутри и вне живых организмов и сама возможность прохождения многих реакций внутри организмов объясняется тем, что в любой живой клетке находятся многочисленные биологические катализаторы, называемые ферментами. Живые организмы могут существовать лишь благодаря их замечательной способности – кинетически контролировать химические превращения. Именно в этом немаловажную роль играют ферменты. Ферменты катализируют такие разнообразные реакции, как гидролиз и дегидрирование, конденсация и изомеризация и многие другие. Согласно классификации, утвержденной Комиссией по ферментам Международного биохимического союза, ферменты подразделяются на шесть классов: 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы; 4) лиазы; 5) изомеразы; 6) лигазы.

Ферменты как биологические катализаторы обладают рядом уникальных свойств, которые выделяют их на фоне обычных катализаторов гомогенного типа. Прежде всего, следует указать на их необычайно высокую каталитическую эффективность. Например, добавка незначительного количества фермента приводит к ускорению катализируемой реакции между субстратами более чем в миллион раз. Применение обычных химических катализаторов, как правило, не позволяет достичь столь больших ускорений процесса. Поэтому превращения веществ вне организма происходят с малой скоростью, требуют высоких температур и высоких концентраций протонов или гидроксил-ионов. В организме же, несмотря на отсутствие высокой температуры, концентрированной кислоты и щелочи, скорость химических реакций, происходящих в протоплазме, достаточно высока.

Большинство известных в настоящее время ферментов представляют собой белки, причем их каталитическая активность зависит от степени сохранности нативной структуры белка. Для проявления ферментативной активности очень важны как первичная, так и вторичная, а также третичная и четвертичная структуры молекул. При нагревании фермента, воздействии на него экстремальных значений pH или денатурирующих агентов его каталитическая активность исчезает. Молекулярные массы ферментов лежат пределах от 12 000 до 1 000 000 дальтон, т. е. их размеры намного превышают размеры субстратов или функциональных групп, на которые они действуют. Например, молекулярный вес b-фруктофуранозидазы превышает 20 000, амилазы составляет 45 000, а каталазы – 230 000.

Механизм действия ферментов связан со снижением энергии активации, необходимой для прохождения химической реакции. Для взаимодействия веществ, осуществления между ними химической реакции требуется сближение молекул этих веществ. Чем больше столкновений между молекулами в единицу времени, тем быстрее протекает реакция. Однако лишь немногие столкновения приводят к химическому взаимодействию между молекулами. Объясняется это тем, что при сближении взаимодействуют только те молекулы, которые обладают достаточной для этого энергией. Такие молекулы можно назвать активированными, или активными. Избыточное количество энергии, необходимое для прохождения реакций между молекулами при столкновении, называется энергией активации.

При ферментативном катализе молекула реагирующего вещества (S) (субстрата) соединяется с ферментом (E), в результате чего снижается величина энергетического барьера, т. е. молекулы субстрата становятся более активными. При этом субстрат присоединяется к специфическому участку фермента, называемому активным центром. Энергия активации комплекса субстрат-фермент ([ES]) будет меньшей, чем энергия активации чистого субстрата. После окончания реакции (образования продукта P) фермент высвобождается и может соединяться с новыми молекулами субстрата:

 

k₁ k₂

[S] + [E] [ES] [P] + [E], (1)

k’₁ k’₂

 

где k_i и k’_i – константы прямых и обратных реакций соответственно.

Скорость биохимического процесса (V), т. е. скорость образования продукта реакции (dP/dt), описываемого схемой (1), зависит от содержания фермента и субстрата и определяется соотношением констант скоростей отдельных стадий процесса. Для описания скорости реакции, катализируемой ферментами, применяется уравнение Михаэлиса–Ментен:

 

(2)

,

=

dP V_max × [S]

dt K_M + [S]

 

где [ S ] – концентрация субстрата; V_max – максимально возможная скорость процесса, достигаемая при [ S ] ; K_M – константа Михаэлиса, численно равная концентрации субстрата, при которой достигается половина максимальной скорости реакции.

В уравнении (2) отсутствуют концентрация фермента и константы отдельных стадий процесса в явном виде. Однако этими параметрами определяются значения V_max (концентрация фермента и k₂) и K_M (k₁, k’₁, k₂):

 

V_max = k₂ × [E] (3)

 

K_M = (k’₁ + k₂) / k₁, (4)

 

где [ E ] – общая концентрация фермента.

Для реального процесса ферментативного катализа возможно значительное число промежуточных стадий:

 

k₁ k₂ k_n k_n+1

[S] + [E] [Х₁] [Х₂] … [Х_n] [P] + [E]. (5)

k’₁ k’₂ k’_n k’_n+1

 

Однако и в этом случае скорость реакции, катализируемой ферментом, описывается уравнением (2), только значения V_max и K_M определяются более сложными выражениями, чем уравнения (3) и (4).

Исходя из уравнения Михаэлиса-Ментен следует ожидать нелинейную зависимость скорости реакции превращения субстрата от концентрации последнего. Действительно, в соответствии с уравнением (2) при высоких концентрациях субстрата, когда выполняется неравенство [ S ] >> К_М, с увеличением содержания субстрата не будет отмечаться значительного роста скорости реакции. В этих условиях достигается (или, точнее, почти достигается) максимально возможная скорость процесса. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата изображена на рис. 4.

В соответствии с зависимостью (2) при использовании ферментов в качестве тест-объектов биосенсорных устройств адекватная оценка содержания определяемого вещества (являющегося субстратом для данного фермента) возможна лишь при относительно низких концентрациях последнего. Верхний концентрационный предел определяется величиной константы Михаэлиса (К_М) и не должен превышать последнюю более чем в 4 раза.

По специфичности действия на субстраты ферменты могут быть разделены на два класса: 1) обладающие почти абсолютной специфичностью по отношению к определенному субстрату и почти не взаимодействующие даже с близкородственными соединениями (табл. 1); 2) специфичные по отношению к какому-либо определенному классу субстратов (табл. 2). В первом случае – это ферменты всех классов, взаимодействующие с каким-либо одним субстратом. Другие субстраты с близкородственной структурой расщепляются гораздо медленнее. Среди этих ферментов, обладающих высокой специфичностью, можно назвать аспартазу, глюкозооксидазу, каталазу, уреазу, декарбоксилазы аминокислот, урикиназу и холестериноксидазу. Аспартаза не взаимодействует с эфирами и амидом фумаровой кислоты, не дезаминирует различного рода монокарбоновые a-аминокислоты. Глюкозооксидаза катализирует окисление D-глюкозы и 2-дезо-ксиглюкозы. С этими субстратами конкурирует единственный ингибитор – b-глюкан.Уреаза гидролизует мочевину и n-нитрофенилкар-бамат; каталаза, по-видимому, расщепляет только перекись водорода. Уникальной специфичностью обладает люцифераза светляков, расщепляющая только АТФ. Высокоспецифичной, по-видимому, является и реакциябактериальной люциферазы с восстановленным ФМН.

 

Таблица 1