Сравнительные характеристики различных методов регенерации никотинамидных коферментов

Параметр	Методы регенерации
Ферментативный	Химический	Электрохими- ческий
Технологичность	Требуется дополнительно фермент и субстрат	Требуется дополнительный реагент	Не требуется дополнительных реагентов
Скорость	Определяется ферментативной активностью	Определяется скоростью химической реакции	Определяется потенциалом элект-рода
Эффективность регенерации	Более 10^6 циклов	10^4–10^3 циклов	10–50 циклов

 

Несмотря на целый ряд преимуществ, ферментативный метод регенерации обладает, однако, и недостатками, обусловленными необходимостью применения дополнительных фермента и субстрата. Реакции трудно сопрягаются с электрохимическими процессами.

Широкий набор химических веществ, способных окислять коферменты, делает этот способ перспективным для регенерации. Скорость окисления НАДН может превышать 10^-4 моль/ с^-1. Эффективность регенерации высока, процесс легко сопрягается с электродными реакциями.

Прямое электрохимическое окисление или восстановление коферментов не требует дополнительных реагентов, скорость контролируется путем изменения потенциала электрода. Однако использование метода ограничено вследствие небольшой его эффективности. Можно предположить, что в будущем удастся увеличить эффективность такой регенерации.

 

 

Синтез водорастворимых

Иммобилизованных никотинамидных

Коферментов

 

Для создания ферментных биосенсоров и изготовления безреагентных аналитических систем на основе дегидрогеназ и других ферментов, катализирующих процессы с участием НАД(Ф), необходимо применение высокомолекулярных производных коферментов. Иммобилизация НАД(Ф) осуществляется путем присоединения к полимерам модифицированных коферментов. Ввиду многоточечного связывания кофермента в активных центрах дегидрогеназ модификация большинства положений в молекуле НАД(Ф) приводит к полной или частичной утрате нативных свойств. Так, модификация НАД по никотинамидному кольцу, участвующему непосредственно в каталитическом акте, приводит к перераспределению электронной плотности, что сильно изменяет его свойства: большинство производных либо проявляют пониженную коферментную активность, либо вовсе не активны. Модификация рибозильных и фосфатных остатков не дает каталитически активных продуктов, и лишь реакции аденинового кольца приводят к образованию коферментно активных производных НАД(Ф).

Наибольшее число активных, модифицированных по адениновому кольцу производных содержат заместители при аминогруппе. Это связано с тем, что аминогруппа некоторых ферментов не участвует в образовании ферментсубстратного комплекса. Так как неподеленная пара электронов азота аминогруппы сопряжена с адениновым кольцом, нуклеофильность остатка понижена. Поэтому многие электрофильные соединения атакуют атом азота в первом положении аденинового кольца, в большей степени обладающего основными свойствами. Такой подход к модификации адениновых коферментов положен в основу многочисленных работ по получению производных НАД(Ф), из которых наиболее широкое распространение получил метод, разработанный Мосбахом. Процесс включает несколько стадий: сначала НАД алкилируется йодуксусной кислотой, затем полученный продукт посредством дитионита восстанавливается в 1-карбоксиметил-НАДН и соединение реокисляется. Применяются и другие способы модификации коферментов по аминогруппе, которые дают каталитически активные производные НАД. В дальнейшем именно эти производные, а не нативные коферменты используются при иммобилизации.

Одностадийный метод синтеза высокомолекулярных производных НАД, обладающих устойчивой связью, заключается в инкубировании 1,2,7,8-диэпоксиоктана в щелочной среде с альгиновой кислотой и НАД, что позволяет получить альгинат-НАД. Для иммобилизации НАД(Ф) применяются и другие водорастворимые полимеры.

Иммобилизованные таким образом коферменты растворимы в воде, однако высокомолекулярный носитель не позволяет такому реагенту диффундировать через полупроницаемые мембраны, которые ограничивают объем ячейки, где протекают биохимические превращения.