Содержания отдельных веществ в среде

Подходы к классификации

Биосенсорных устройств

 

Ранее указывалось, что не возможно представить ни универсальный биологический тестирующий элемент, ни физико-химический датчик, пригодные на все случаи. Поэтому конструкции биосенсорных устройств в значительной степени различаются. В связи с этим классификация биосенсоров весьма затруднительна. Укажем основные подходы к решению этой проблемы.

Прежде всего, коснемся вопроса конструктивной особенности биосенсорного устройства по взаимному расположению биологического тестирующего элемента и датчика, регистрирующего состояние тест-объекта. В классической схеме эти две компоненты непосредственно связаны. Однако существует компоновка биосенсорных устройств, где биологический аналитический узел и измерительная система разделены. Это биосенсоры реакторного типа. Устройство состоит из следующих главных частей: узлов транспорта, смешивания и термостатирования анализируемых растворов и реагентов, аналитического узла на основе иммобилизованных тест-объектов и измерительной системы (рис. 3). Определение метаболитов происходит при непрерывном потоке раствора. Известны также упрощенные варианты систем, в которых узлы транспорта и смешивания растворов отсутствуют или аналитический узел с измерительной системой смонтированы в одном блоке. В упрощенных системах биокатализатор захватывается на магнитной мешалке или отделяется от измерителя полупроницаемой мембраной. Все эти системы различаются по принципу действия и инструментальному оформлению.

В анализаторах этого типа применяются ковалентно пришитые ферменты. Наиболее часто в качестве носителя используется пористое стекло. В первых аналитических системах использовались включенные в акриламидный гель глюкозооксидаза и лактатдегидрогеназа. Первые автоматические системы на основе колоночных мини-реакторов появились в 70-е гг. Концентрация продуктов определялась спектрофотометрическим способом по образованию окрашенных соединений.

 

Рис. 3. Структурная схема автоматической аналитической системы на основе мини-реактора: 1 – автоматический пробоотборник; 2 – перистальтический насос; 3 – термостат; 4 – отделитель воздушных прослоек; 5 – аналитический мини-реак-тор; 6 – измеритель; 7 – блок управления; 8 – усилитель; 9 – самописец. а – каналы транспортировки пробы; б – воздух; в – буферный раствор; г, д – сток раствора

 

Глюкозный анализатор на основе мини-реактора прост в изготовлении и обладает высокой точностью в интервале концентраций углевода от 10^-4 до 2,3×10^-2 М. В течение 10-дневного периода наблюдается небольшое увеличение чувствительности прибора. Заменой глюкозооксидазы другими ферментами, продукты которых определяются стандартным образом, можно расширить диапазон определяемых субстратов.

В некоторых работах аналитические системы реакторного типа не относятся к биосенсорным устройствам. Однако указанные системы обладают практически всеми признаками биосенсорных устройств. Более того, возможен анализ проб с помощью этих систем в двух режимах: статическом и динамическом. Первый режим предполагает проведение биохимического процесса в мини-реакторе «до конца», а определение содержания анализируемого вещества основывается на анализе количества продукта на выходе из реактора; этот режим незаменим при проведении анализа веществ, содержащихся в микроколичествах в малых объемах проб. Работа во втором режиме основана на определении скорости биохимической реакции. Аналитическое определение содержания того или иного вещества предполагает поддержание постоянной скорости протока и температуры пробы в мини-реакторе и калибровку аналитической системы по стандартным растворам.

Наиболее распространены в настоящее время подходы к классификации биосенсоров, основанные на определении типа биологической компоненты или физико-химического датчика («биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов», «электрохимические», «оптические», «акустические» биосенсоры и т. д.). Иногда в классификационном обозначении присутствуют типы как биологического, так и физико-химического элементов (например, «ферментный электрод»). В других вариантах называется тип электронного или оптического устройства, на основе которого осуществляется передача сигнала к анализатору («ионоселективный полевой транзистор», «люминесцентный волоконнооптический датчик» и т. д.). По мере роста производства биосенсоров классификация их будет совершенствоваться, при этом определяющее значение, возможно, будут иметь и наименования первых или наиболее крупных производителей.

 

 

Тест-объект биосенсора

 

Основным компонентом биосенсорного устройства является биологический чувствительный элемент. Именно по его реакции на действие определяемого вещества, по тем процессам, которые протекают в присутствии анализируемых соединений на нем, и производится качественный или количественный анализ пробы среды. Благодаря вполне определенным свойствам этого компонента биосенсорного устройства обеспечивается высокая чувствительность аналитической системы, селективность и точность измерений.

Среди названий биологических тестирующих элементов, приводимых в работах, посвященных биосенсорам, можно встретить такие, как биоспецифическая поверхность, биодатчик или некоторые другие. Но, как указано в разделе 1.2, с целью унификации терминов в процессе изложения материала этот элемент будет именоваться тест-объектом.

В качестве тест-объекта биосенсорного устройства могут быть использованы различные компоненты биологических систем – ферменты, антитела, антигены, нуклеиновые кислоты, рецепторы, клеточные органеллы, клетки, ткани, отдельные живые организмы и др. Однако любой из указанных компонентов сам по себе еще не является тест-объектом биосенсорного устройства. Дело в том, что молекулярные компоненты клетки могут растворяться в среде, подвергаться процессам биологической и химической деструкции, инактивироваться и т. д.; для живых организмов характерны процессы адаптации, сенсибилизации или какие-либо другие, которые в конечном итоге могут привести к искажению их реакции на воздействие анализируемой среды. Для того чтобы выбранный нами компонент живого организма (или сам организм) стал полноценным элементом биосенсорного устройства, необходима дополнительная его обработка, обеспечивающая работоспособность биологического компонента в устройстве. Суть процедур дополнительной обработки биологических компонентов выбирается в каждом конкретном случае отдельно, но существует и ряд практически универсальных способов такого рода манипуляций (например, иммобилизация), которые будут обсуждены далее.

Таким образом, определим тест-объект биосенсорного устройства как компонент аналитической системы биологического происхождения, обработанный специальным образом с целью обеспечения работоспособности, высокой чувствительности и селективности, а также долговечности биосенсора.

Тест-объект биосенсорного устройства должен удовлетворять ряду требований, главными из которых являются: 1) доступность; 2) относительно невысокая стоимость; 3) безопасность в эксплуатации (следует упомянуть, что в качестве тест-объекта могут быть использованы бактерии и нуклеиновые кислоты, кроме того, биосенсор может применяться, например, для анализа компонентов воды в сети водоснабжения или работающего биореактора; в этих условиях указанное требование приобретает особую актуальность); 4) тест-объект должен быть селективен по отношению к определяемому веществу (или группе веществ); 5) должен обеспечивать воспроизводимость результатов анализа; 6) должен быть работоспособным в заданном диапазоне параметров среды (температура, давление, влажность, рН, ионная сила и т. п.). Указанный список требований отнюдь не полный, и в каждом конкретном случае могут быть оговорены и другие требования.

Названным требованиям в той или иной мере отвечают все те упомянутые ранее биологические компоненты (ферменты, антитела, рецепторы и др.), применяемые в биосенсорных устройствах. Следует, однако, отметить, что идеальный вариант, т. е. биологический тестирующий элемент, полностью удовлетворяющий хотя бы указанным требованиям, подобрать практически невозможно. Поэтому реально выбирается оптимальный вариант. Вероятно, последнее частично и объясняет наличие значительного разнообразия тест-объектов даже в однотипных конструкциях биосенсорных устройств, предназначенных для определения содержания какого-либо определенного вещества.

 

Ферменты как тест-объект

Биосенсорного устройства

 

Ферменты – это наиболее популярные тест-объекты биосенсорных устройств. Достаточно упомянуть, что первые биосенсоры (ферментные электроды для определения содержания глюкозы) представляли собой конструкции на основе ферментов. Да и первые промышленно выпускаемые биосенсоры (и большинство ныне известных промышленно производимых биосенсорных устройств) тоже изготавливались на основе ферментов. В настоящее время известны работы по синтезу некоторых ферментов. Однако эти процедуры достаточно сложны и дорогостоящи. Поэтому сейчас реальны и наиболее распространены методики выделения ферментов из биологических объектов.

В живых организмах постоянно происходят самые разнообразные химические реакции. При фотосинтезе, дыхании, усвоении питательных веществ, в процессе синтеза и распада белков, жиров, углеводов, витаминов и других соединений мы постоянно встречаемся со сложнейшими реакциями, лишь с трудом воспроизводимыми вне организма. Между тем в биосистемах эти реакции протекают очень легко и с высокой скоростью. Большое различие в скоростях реакций внутри и вне живых организмов и сама возможность прохождения многих реакций внутри организмов объясняется тем, что в любой живой клетке находятся многочисленные биологические катализаторы, называемые ферментами. Живые организмы могут существовать лишь благодаря их замечательной способности – кинетически контролировать химические превращения. Именно в этом немаловажную роль играют ферменты. Ферменты катализируют такие разнообразные реакции, как гидролиз и дегидрирование, конденсация и изомеризация и многие другие. Согласно классификации, утвержденной Комиссией по ферментам Международного биохимического союза, ферменты подразделяются на шесть классов: 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы; 4) лиазы; 5) изомеразы; 6) лигазы.

Ферменты как биологические катализаторы обладают рядом уникальных свойств, которые выделяют их на фоне обычных катализаторов гомогенного типа. Прежде всего, следует указать на их необычайно высокую каталитическую эффективность. Например, добавка незначительного количества фермента приводит к ускорению катализируемой реакции между субстратами более чем в миллион раз. Применение обычных химических катализаторов, как правило, не позволяет достичь столь больших ускорений процесса. Поэтому превращения веществ вне организма происходят с малой скоростью, требуют высоких температур и высоких концентраций протонов или гидроксил-ионов. В организме же, несмотря на отсутствие высокой температуры, концентрированной кислоты и щелочи, скорость химических реакций, происходящих в протоплазме, достаточно высока.

Большинство известных в настоящее время ферментов представляют собой белки, причем их каталитическая активность зависит от степени сохранности нативной структуры белка. Для проявления ферментативной активности очень важны как первичная, так и вторичная, а также третичная и четвертичная структуры молекул. При нагревании фермента, воздействии на него экстремальных значений pH или денатурирующих агентов его каталитическая активность исчезает. Молекулярные массы ферментов лежат пределах от 12 000 до 1 000 000 дальтон, т. е. их размеры намного превышают размеры субстратов или функциональных групп, на которые они действуют. Например, молекулярный вес b-фруктофуранозидазы превышает 20 000, амилазы составляет 45 000, а каталазы – 230 000.

Механизм действия ферментов связан со снижением энергии активации, необходимой для прохождения химической реакции. Для взаимодействия веществ, осуществления между ними химической реакции требуется сближение молекул этих веществ. Чем больше столкновений между молекулами в единицу времени, тем быстрее протекает реакция. Однако лишь немногие столкновения приводят к химическому взаимодействию между молекулами. Объясняется это тем, что при сближении взаимодействуют только те молекулы, которые обладают достаточной для этого энергией. Такие молекулы можно назвать активированными, или активными. Избыточное количество энергии, необходимое для прохождения реакций между молекулами при столкновении, называется энергией активации.

При ферментативном катализе молекула реагирующего вещества (S) (субстрата) соединяется с ферментом (E), в результате чего снижается величина энергетического барьера, т. е. молекулы субстрата становятся более активными. При этом субстрат присоединяется к специфическому участку фермента, называемому активным центром. Энергия активации комплекса субстрат-фермент ([ES]) будет меньшей, чем энергия активации чистого субстрата. После окончания реакции (образования продукта P) фермент высвобождается и может соединяться с новыми молекулами субстрата:

 

k₁ k₂

[S] + [E] [ES] [P] + [E], (1)

k’₁ k’₂

 

где k_i и k’_i – константы прямых и обратных реакций соответственно.

Скорость биохимического процесса (V), т. е. скорость образования продукта реакции (dP/dt), описываемого схемой (1), зависит от содержания фермента и субстрата и определяется соотношением констант скоростей отдельных стадий процесса. Для описания скорости реакции, катализируемой ферментами, применяется уравнение Михаэлиса–Ментен:

 

(2)

,

=

dP V_max × [S]

dt K_M + [S]

 

где [ S ] – концентрация субстрата; V_max – максимально возможная скорость процесса, достигаемая при [ S ] ; K_M – константа Михаэлиса, численно равная концентрации субстрата, при которой достигается половина максимальной скорости реакции.

В уравнении (2) отсутствуют концентрация фермента и константы отдельных стадий процесса в явном виде. Однако этими параметрами определяются значения V_max (концентрация фермента и k₂) и K_M (k₁, k’₁, k₂):

 

V_max = k₂ × [E] (3)

 

K_M = (k’₁ + k₂) / k₁, (4)

 

где [ E ] – общая концентрация фермента.

Для реального процесса ферментативного катализа возможно значительное число промежуточных стадий:

 

k₁ k₂ k_n k_n+1

[S] + [E] [Х₁] [Х₂] … [Х_n] [P] + [E]. (5)

k’₁ k’₂ k’_n k’_n+1

 

Однако и в этом случае скорость реакции, катализируемой ферментом, описывается уравнением (2), только значения V_max и K_M определяются более сложными выражениями, чем уравнения (3) и (4).

Исходя из уравнения Михаэлиса-Ментен следует ожидать нелинейную зависимость скорости реакции превращения субстрата от концентрации последнего. Действительно, в соответствии с уравнением (2) при высоких концентрациях субстрата, когда выполняется неравенство [ S ] >> К_М, с увеличением содержания субстрата не будет отмечаться значительного роста скорости реакции. В этих условиях достигается (или, точнее, почти достигается) максимально возможная скорость процесса. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата изображена на рис. 4.

В соответствии с зависимостью (2) при использовании ферментов в качестве тест-объектов биосенсорных устройств адекватная оценка содержания определяемого вещества (являющегося субстратом для данного фермента) возможна лишь при относительно низких концентрациях последнего. Верхний концентрационный предел определяется величиной константы Михаэлиса (К_М) и не должен превышать последнюю более чем в 4 раза.

По специфичности действия на субстраты ферменты могут быть разделены на два класса: 1) обладающие почти абсолютной специфичностью по отношению к определенному субстрату и почти не взаимодействующие даже с близкородственными соединениями (табл. 1); 2) специфичные по отношению к какому-либо определенному классу субстратов (табл. 2). В первом случае – это ферменты всех классов, взаимодействующие с каким-либо одним субстратом. Другие субстраты с близкородственной структурой расщепляются гораздо медленнее. Среди этих ферментов, обладающих высокой специфичностью, можно назвать аспартазу, глюкозооксидазу, каталазу, уреазу, декарбоксилазы аминокислот, урикиназу и холестериноксидазу. Аспартаза не взаимодействует с эфирами и амидом фумаровой кислоты, не дезаминирует различного рода монокарбоновые a-аминокислоты. Глюкозооксидаза катализирует окисление D-глюкозы и 2-дезо-ксиглюкозы. С этими субстратами конкурирует единственный ингибитор – b-глюкан.Уреаза гидролизует мочевину и n-нитрофенилкар-бамат; каталаза, по-видимому, расщепляет только перекись водорода. Уникальной специфичностью обладает люцифераза светляков, расщепляющая только АТФ. Высокоспецифичной, по-видимому, является и реакциябактериальной люциферазы с восстановленным ФМН.

 

Таблица 1

В аналитических системах

 

Фермент	Субстрат
АМФ-деаминаза	Аденозин монофосфат
Аспартаза	L-аспартат
Глутаматдекарбоксилаза	L-глутамат
Глутаматдегидрогеназа	L-глутамат
Глюкозооксидаза	D-глюкоза
Инвертаза	Сахароза
Каталаза	Перекись водорода
Лактатдегидрогеназа	L-лактат, пируват
Лизиндекарбоксилаза	L-лизин
Люцифераза светляков	АТФ
Люцифераза бактерий	Флавинмононуклетид восст.
Малатдегидрогеназа	Оксалоацетат
Мутаротаза	D-глюкоза
Нитратредуктаза	Нитрат ион
Нитритредуктаза	Нитрит ион
Уреаза	Мочевина
Урикиназа	Мочевая кислота
Тирозиндекарбоксилаза	L-тирозин
Фенилаланиндекарбоксилаза	a-фенилаланин
Холестериноксидаза	Холестерин

Декарбоксилазы катализируют превращение только отдельных аминокислот. Наиболее высокой специфичностью обладает лизиндекарбоксилаза. Характерно, что ферменты класса трансфераз, изомераз и лигаз, осуществляющие тонкие биохимические превращения в клетке, как правило, обладают высокой специфичностью.

 

Во втором случае – это ферменты, обладающие групповой специфичностью. К ним относятся гидролазы и оксидоредуктазы. Синтезируя эти ферменты, клетки утилизируют источники питания и метаболиты таким образом, чтобы нейтрализовать действие соединений, вредных для жизнедеятельности организма. Они катализируют окисление аминокислот и ароматических соединений, гидролиз эфиров сахаров, фосфорной и серной кислот, разрушение лактамного кольца в производных 6-аминопенициллиновой кислоты и др. Кроме того, велика их роль в выявлении молекулярных механизмов катализа специфических химических реакций.

Факторы, влияющие на процесс ферментативного катализа. Каталитическая активность ферментов зависит от ряда факторов. Упомянем лишь те, которые могут оказывать существенное влияние на работоспособность биосенсорного устройства: температура, ионный состав среды, наличие в среде тяжелых металлов и других ферментных ингибиторов.

По мере возрастания температуры обычно скорость химической реакции возрастает. Это же правило характерно и для реакций, катализируемых ферментами, но для ограниченного диапазона температур. Зависимость скорости процесса, катализируемого ферментами, характеризуется наличием оптимума (рис. 5), т. е. скорость реакции растет лишь до определенного значения температуры. Дальнейшее по-вышение температуры резко снижает активность фермента. Следует отметить, что значение величины оптимальной температуры для различных ферментов или одного и того же фермента, выделяемого из разных биологических объектов, сильно различается. Поэтому именно подбором организма, из которого выделяется фермент, и подбором фермента, для которого определяемое вещество является субстратом, в большинстве случаев удается найти подходящий тест-объект биосенсора, который будет работоспособным в оговоренном диапазоне температур. Однако и в данном случае возможности подбора далеко не безграничны, большинство ферментов необратимо денатурируются при нагреве их свыше 45–50 ^oС.

Зависимость каталитической активности ферментов от рН среды в некоторой степени напоминает выше рассмотренную для температуры (рис. 6). И в этом случае существует оптимальное значение кислотности среды, при которой активность фермента максимальна. Отклонение рН в кислую или щелочную область от оптимального значения резко снижает активность фермента. Значение оптимальной величины рН для каждого фермента индивидуально и колеблется в очень широких пределах. При этом ферменты, относящиеся к одному и тому же классу и катализирующие одни и те же реакции, но извлеченные из разных организмов (или разных органов одного организма), могут чрезвычайно различаться по величине оптимального значения рН. Например, протеолитические ферменты пепсин и папаин характеризуются оптимумами рН около 1,0 и 7,0 соответственно, т. е. и в этом

 

V_max

 

рН

3 4 5 6 7 8

 

Рис. 6. Зависимость максимальной скорости ферментативной

Реакции от рН

 

случае среди значительного разнообразия ферментов принципиально возможно выбрать подходящий вариант.

Ионы тяжелых металлов являются эффективными ингибиторами ферментов. Действие их на белковые глобулы проявляется по-разному. Возможна химическая модификация аминокислотных остатков, главным образом цистеина, с образованием сульфидов солей. Если остаток цистеина входит в активный центр фермента или в фрагмент молекулы, ответственный за поддержание нативной структуры глобулы белка, модификации тиольных остатков инактивирует катализатор. Наиболее универсальное ингибирующее действие ионов металлов связано с их способностью образовывать координационные связи. Как известно, входящие в активные центры ферментов нуклеофильные остатки гистидина, лизина и т. д. весьма склонны к образованию координационных связей с ионами тяжелых металлов. Наконец, ионы тяжелых металлов переменной валентности (меди, железа) катализируют окисление аминокислотных остатков. Взаимодействие ионов металлов с белковыми молекулами, как правило, протекает необратимо, поэтому самый лучший способ защиты фермента от действия этих ингибиторов заключается в удалении свободных ионов путем очистки, комплексообразования при помощи добавляемых реагентов (ЭДТА) или путем связывания в нерастворимые соли.

Механизм действия перекиси водорода до конца не выяснен; по-видимому, основная причина инактивации заключается в окислении функционально важных групп фермента.

С другой стороны, сильная зависимость величины ферментативной активности от присутствия низкомолекулярных ингибиторов в значительной мере расширяет возможности применения ферментов в аналитических целях. Во всяком случае, тест-объекты на основе ферментов могут быть использованы не только при анализе биогенных субстратов, но и для определения содержания токсических неорганических соединений, например тяжелых металлов и перекисей.

Высокая каталитическая способность и специфичность ферментов определяет их применение в качестве аналитических реагентов. Простой расчет показывает,что в условиях реакции первого порядка для превращения 99 % исходного субстрата в течение 1 мин требуется всего 0,14 мкМ фермента, обладающего «средними» каталитическими параметрами. Количество фермента может быть значительно уменьшено при использовании кинетического метода определения скорости превращения субстрата.

Использование высокоспецифичных ферментов позволяет селективно определять субстраты в присутствии других соединений. Вместе с тем ферменты с групповой специфичностью используются для обнаружения таких классов соединений, как антибиотики (пенициллиназа), токсичные гидросилированные производные бензола (полифенолоксидаза) и т. д.

В обычных методиках анализа процесс контролируется с применением одного из физико-химических способов оценки потребления, исходных реагентов или образования продуктов реакции, при этом ферменты расходуются так же, как и другие реагенты. Благодаря иммобилизации ферментов создалась возможность многократного применения биокатализаторов. На основе этих гетерогенных ферментов были созданы принципиально новые аналитические системы – биосенсоры, которые нашли широкое применение в научной практике и на производстве.

В конце данного раздела укажем основные достоинства и недостатки ферментов как тест-объектов биосенсорных устройств. К достоинствам относятся:

Высокая селективность.

2. Высокая чувствительность (обусловлена каталитической активностью ферментов).

3. Возможность подбора фермента с соответствующими техническому заданию свойствами (ферменты достаточно давно исследуются, проведена их классификация, установлены содержание и локализация многих ферментов в отдельных организмах).

Относительно низкая стоимость (хотя в целом процедуры выделения и очистки указанных препаратов достаточно трудоемки, однако налажено промышленное производство значительного числа ферментов, используемых в биотехнологическом производстве. Именно увеличение масштабов производства и дает возможность снизить их себестоимость).

Характеристика антител

Элемент биосенсоров

 

Рецепторы – компоненты биологических мембран, обладающие высокой степенью избирательности по отношению к молекулам, взаимодействующим с ними. Основные концепции теории рецепторов глубоко проникли в идеологию современных исследователей, занятых изучением механизмов действия физиологически активных соединений. Биологически активные соединения обычно подразделяют на агонисты – вещества, связывающиеся с рецепторами и индуцирующие биологический ответ, и антагонисты – соединения, препятствующие взаимодействию агониста и не вызывающие или ослабляющие биологическую реакцию. Не исключено, что среди большого количества ксенобиотиков имеются вещества, специфически связывающиеся с рецептором, причем как сами вещества, так и рецепторы пока являются неизвестными. В этой связи и представляется целесообразным рассмотреть некоторые вопросы, касающиеся концепции рецепторов.

Истоки теории рецепторов принято обычно искать в работах Лэнгли и Эрлиха. Последний на рубеже XIX–XX вв. сформулировал знаменитый принцип: вещества не действуют, не будучи связанными. Дальнейшее развитие теория рецепторов получила при изучении действия различных гормонов. Установленные факты по влиянию гормонов позволили предположить, что последние связываются с расположенными на поверхности специальными структурами – рецепторами, т. е. молекулами, способными «узнавать» гормон, взаимодействовать с ним и передавать информацию о его присутствии. Однако достоверно доказать наличие рецепторов на мембранах не так-то просто. Это связано, с одной стороны, с их чрезвычайно низкой концентрацией, лабильностью и неоднородностью. С другой стороны, на поверхности любой клетки имеются мембранные компоненты, неспецифически связывающие тот или иной гормон (эффектор), т. е. не все места, связывающие гормон, являются рецепторами.

Вообще говоря, весьма трудно дать точное определение понятию «рецептор». Согласно определению, данному Вудом, агонистами рецепторов могут быть вещества со следующими четырьмя признаками: 1) они действуют в низких (микромолярных) концентрациях; 2) их активность в сильной мере зависит от изменений в химической структуре; 3) их активность может подавляться селективными антагонистами (например, атропин может сильно блокировать действие ацетилхолина на восходящую ободочную кишку морской свинки, но практически не изменяет активность гистамина); 4) активность антагонистов также сильно зависит от изменений в химической структуре.

В определении, данном Куатреказасом, перечисляются следующие основные признаки рецепторов: 1) взаимодействие эффектора с рецептором должно отвечать требованиям определенной пространственной и структурной специфичности; 2) количество связывающих мест должно быть ограниченным, и, следовательно, связывающие места должны быть насыщаемыми; 3) связывание эффектора должно иметь тканевую специфичность, соответствующую его биологической функции; 4) связывающие места должны обладать высоким сродством к гормону, а их концентрация должна соответствовать физиологической концентрации гормона; 5) связывание эффектора рецептором должно быть обратимым.

Для строгого доказательства наличия рецепторов на мембране лучше всего выделить этот компонент, очистить, затем встроить в искусственную бислойную липидную мембрану или липосому и показать, что он сохраняет биологическую активность.

Выделенные рецепторы оказались гликопротеинами или гликолипидами. Молекула любого рецептора состоит, по крайней мере, из двух частей. Одна из них, наружная, служит для связывания вещества (гормона). Основную роль в этом играют полисахаридные цепи молекулы рецептора. Вторая, менее полярная, часть молекулы рецептора служит для ее закрепления в липидном бислое и передачи принятого сигнала внутрь клетки. Взаимодействие между связывающими и передающими участками осуществляется благодаря конформационным перестройкам, происходящим в результате «посадки» эффектора (агониста) на связывающий участок рецептора. В этом случае происходят небольшие изменения на отдельных участках мембран, результаты которых передаются внутрь клетки, усиливаясь с помощью определенного («релейного») механизма, и в конце концов определяют течение внутриклеточных процессов. В основе передачи сигнала в ряде случаев лежит активация и инактивация аденилатциклазы (АЦ), расположенной в мембране. Этот фермент отвечает за синтез нуклеотида – цАМФ.

В нормальном состоянии активность аденилатциклазы подавлена. Но при взаимодействии агониста с рецептором (Â) на поверхности мембраны аденилатциклаза (АЦ) активируется. В результате усиливается синтез цАМФ, увеличивается концентрация последнего внутри клетки и активируется один или несколько ферментов, расположен

	Â

Рис. 7. Аденилатный путь регуляции внутриклеточных процессов.

Пояснения в тексте

 

ных внутри клетки. Таким образом, химический сигнал передается от одного посыльного к другому. Первичным посыльным является эффектор (гормон, медиатор); через ГТФ-связывающий G-белок и аденилатциклазу он передает сообщение внутрь клетки (рис. 7). Вторичные посредники не только способствуют передаче внешнего сигнала во внутриклеточный, но и обеспечивают значительное усиление первоначального сигнала. Каждая молекула рецептора, присоединившая сигнальную молекулу, активирует много молекул аденилатциклазы, которые, в свою очередь, катализируют образование множества молекул цАМФ. В итоге по всей цепи от рецептора до клеточной реакции происходит усиление сигнала в 10⁷–10⁸ раз. Таким образом, несколько сигнальных молекул гормона или медиатора могут изменять функциональную или метаболическую активность всей клетки.

Признанными вторичными мессенджерами являются и ионы кальция. Кальций участвует в регуляции внутриклеточных процессов в комбинации с двумя другими вторичными посредниками – инозитолтрифосфатом и диацилглицеролом.

На поверхности плазматических мембран разных клеток число рецепторов варьирует. Так, на поверхности одной клетки печени имеется 250 000 рецепторов инсулина, тогда как на поверхности клеток щитовидной железы их число не превышает 500. Часть рецепторов может «плавать» в плоскости мембраны, но большее их количество фиксировано системой микрофиламентов и микротрубочек.

Для рецепторов характерно, во-первых, высокое сродство, проявляющееся в том, что агент действует при низкой концентрации (10^-9М и ниже); во-вторых, кривая, описывающая процесс взаимодействия эффектора с местами связывания на мембране от его концентрации, должна выходить на плато, поскольку количество рецепторов (мест связывания) ограничено; в-третьих, биологическая активность пар оптических изомеров (стереоспецифичность) различна (так, например, право- и левовращающиеся формы атропина, морфина и адреналина сильно отличаются друг от друга по биологической активности); в-четвертых, имеет место тканевая специфичность биологического действия веществ (например, адреналин оказывает мощное действие на сердечную мышцу, но очень слабо действует на поперечно-полосатые мышцы). Далее следует отметить, что взаимодействие агонист-рецептор возможно только при строгом соответствии пространственных и зарядовых геометрий. Необходимо учитывать и то, что связывание эффектора с рецептором должно быть обратимым. Так, одна и та же химическая группа в зависимости от своего химического окружения может обусловливать действие как агониста, так и антагониста; как пример можно привести ацетилхолин и тубокурарин. Эти соединения действуют на один и тот же рецептор, но меньшая молекула (ацетилхолин) точно соответствует участку связывания и активирует рецептор; большая молекула (тубокурарин) перекрывает рецептор и оказывает блокирующее действие.

Все вышеуказанное представляет рецепторы как вполне подходящие тест-объекты для биосенсорных устройств. Однако столь замечательные свойства рецепторов в основном проявляются лишь в составе