Как тест-объектов биосенсоров

 

Среди множества различных белков, встречающихся в живых организмах, имеются протеины особого типа – это антитела. Молекулы антител появляются в сыворотке крови и тканях живого организма в ответ на проникновение в последний антигена – белка или какого-либо другого соединения, чужеродного данному организму. Эта реакция называется иммунной.

Молекулы антител (Ат) соединяются с молекулами антигенов (Аг), образуя комплекс антиген-антитело ([Ат-Аг]). При протекании такой реакции in vitro происходит образование осадка или помутнение жидкости – реакция преципитации. В осадок выпадают или вызывают помутнение коагуляты комплекса антиген-антитело.

Реакция антиген-антитело достаточно давно используется в целях клинического анализа. За десятилетия применения этой реакции введены в практику различные варианты методики проведения визуальных исследований. Одна из таких методик заключается в том, что реакция преципитации проводится не в жидкости, а в геле: антиген и антитело диффундируют навстречу друг другу в блоке геля агар-агара. Место образования комплекса антиген-антитело обнаруживается в виде рассеивающей свет полосы внутри агарового блока.

Однако наиболее интенсивно антитела стали использовать для аналитических целей в последние 30–40 лет. В этот период были разработаны и внедрены в практику методы получения и выделения антител с заранее заданными свойствами, кроме того, применены прогрессивные методики оценки концентрации комплекса антиген-антитело, что позволило многократно повысить пределы обнаружения анализируемых веществ. В настоящее время на основе реакции антиген-антитело построено целое направление аналитических исследований. Столь значительный интерес к этой реакции связан прежде всего с тем, что антитела обнаруживают чрезвычайно высокую специфичность к антигенам. Более того, эта специфичность касается не только первичной структуры антигена, но и вполне определенной вторичной. Во всяком случае, антитела, выработанные по отношению к определенным белкам, не взаимодействуют с денатурированными формами последних, полученными, например, нагреванием.

Антитела имеют особые участки связывания с антигеном, комплементарные соответствующим структурам молекул последнего. Обычно в результате взаимодействия антигенов и антител образуется трехмерная структура в виде решетки из чередующихся молекул антигенов и антител.

Современные методы иммунного анализа основаны на количественной оценке концентрации комплекса антиген-антитело. При наличии в среде антигена и антител в концентрациях [ Аг ] и [ Ат ] соответственно содержание комплекса [ Ат-Аг ] будет определяться константой сродства К_с:

 

[Аг] × [Ат]

К_с =. (6)

[Ат-Аг]

 

Следовательно, при фиксированной концентрации, например, свободных антител в условиях равновесия компонентов реакции отношение концентраций связанных и свободных молекул антигена определяется константой сродства и концентрацией антител:

 

[Ат-Аг] / [Аг] = К_с × [Ат]. (7)

 

На оценках количественного соотношения компонентов реакции антиген-антитело базируются все известные методы иммунного анализа. На первых этапах развития иммунного анализа для количественного определения содержания компонентов использовались главным образом методы меченых атомов. Ряд неудобств, связанных с применением радиоактивных материалов, привел к поиску новых методик. Результатом поиска явилась разработка иммуноферментного анализа (ИФА). Способность ферментов эффективно катализировать химические реакции позволяет осуществлять их обнаружение в концентрациях, сравнимых с концентрацией изотопных меток.

В настоящее время ИФА является одним из наиболее быстро развивающихся аналитических методов и применяется в паразитологии, вирусологии, бактериологии, токсикологии, сельском хозяйстве. Привлекательность ИФА состоит в том, что он безопасен для здоровья; срок службы ферментов-маркеров составляет несколько лет, метод применим ко всем системам антиген-антитело, чрезвычайно чувствителен. ИФА дает возможность обнаруживать антигены, антитела и другие субстанции в биологических жидкостях в концентрациях 10^-14–10^-12 М. Благодаря таким достоинствам разработаны иммуноферментные методы определения сывороточных белков, гормонов, ферментов, антибиотиков, лекарственных препаратов различных групп, бактериальных, вирусных и грибковых антигенов, микроорганизмов и направленных против них антител. В процессе развития метода ИФА возникли различные его модификации. В определенном смысле некоторые варианты конструкций биосенсорных устройств можно считать развитием отдельных модификаций.

Перечислим основные достоинства антител как тест-объектов биосенсорных устройств.

1. Высокая селективность.

2. Высокая чувствительность, связанная с исключительно большим значением константы сродства антитела к антигену.

3. Возможность на основе реакции антиген-антитело определять содержание как антигенов, так и антител.

4. Относительная доступность материала, обусловленная тем, что ИФА интенсивно внедряется в практику.

Среди недостатков укажем следующие:

1. Достаточно высокую стоимость.

2. Пригодность для анализа относительно ограниченного круга веществ.

3. Необходимость в большинстве случаев их дополнительной модификации («пришивка метки»).