Высокоспецифичные ферменты, применяемые

В аналитических системах

 

Фермент	Субстрат
АМФ-деаминаза	Аденозин монофосфат
Аспартаза	L-аспартат
Глутаматдекарбоксилаза	L-глутамат
Глутаматдегидрогеназа	L-глутамат
Глюкозооксидаза	D-глюкоза
Инвертаза	Сахароза
Каталаза	Перекись водорода
Лактатдегидрогеназа	L-лактат, пируват
Лизиндекарбоксилаза	L-лизин
Люцифераза светляков	АТФ
Люцифераза бактерий	Флавинмононуклетид восст.
Малатдегидрогеназа	Оксалоацетат
Мутаротаза	D-глюкоза
Нитратредуктаза	Нитрат ион
Нитритредуктаза	Нитрит ион
Уреаза	Мочевина
Урикиназа	Мочевая кислота
Тирозиндекарбоксилаза	L-тирозин
Фенилаланиндекарбоксилаза	a-фенилаланин
Холестериноксидаза	Холестерин

Декарбоксилазы катализируют превращение только отдельных аминокислот. Наиболее высокой специфичностью обладает лизиндекарбоксилаза. Характерно, что ферменты класса трансфераз, изомераз и лигаз, осуществляющие тонкие биохимические превращения в клетке, как правило, обладают высокой специфичностью.

 

Ферменты, обладающие групповой специфичностью

 

Фермент	Субстрат
Алкогольдегидрогеназа	Спирты
Арилсульфатаза	Эфиры серной кислоты
b-глюкозидаза	b-глюкозиды
Диаминооксидаза	Биогенные амины
Оксидазы D-аминокислот	D-аминокислоты
Оксидазы L-аминокислот	L-аминокислоты
Пенициллиназа	Производные 6-аминопенициллиновой к-ты
Пенициллинамидаза	Пенициллины и другие соединения
Пероксидаза	Ароматические соединения
Протеазы (химотрипсин, трипсин)	Эфиры аминокислот
Полифенолоксидаза	Замещенные фенолы
Холинэстераза	Эфиры холина и тиохолина
Щелочная фосфатаза	Эфиры фосфорной к-ты

Во втором случае – это ферменты, обладающие групповой специфичностью. К ним относятся гидролазы и оксидоредуктазы. Синтезируя эти ферменты, клетки утилизируют источники питания и метаболиты таким образом, чтобы нейтрализовать действие соединений, вредных для жизнедеятельности организма. Они катализируют окисление аминокислот и ароматических соединений, гидролиз эфиров сахаров, фосфорной и серной кислот, разрушение лактамного кольца в производных 6-аминопенициллиновой кислоты и др. Кроме того, велика их роль в выявлении молекулярных механизмов катализа специфических химических реакций.

Факторы, влияющие на процесс ферментативного катализа. Каталитическая активность ферментов зависит от ряда факторов. Упомянем лишь те, которые могут оказывать существенное влияние на работоспособность биосенсорного устройства: температура, ионный состав среды, наличие в среде тяжелых металлов и других ферментных ингибиторов.

По мере возрастания температуры обычно скорость химической реакции возрастает. Это же правило характерно и для реакций, катализируемых ферментами, но для ограниченного диапазона температур. Зависимость скорости процесса, катализируемого ферментами, характеризуется наличием оптимума (рис. 5), т. е. скорость реакции растет лишь до определенного значения температуры. Дальнейшее по-вышение температуры резко снижает активность фермента. Следует отметить, что значение величины оптимальной температуры для различных ферментов или одного и того же фермента, выделяемого из разных биологических объектов, сильно различается. Поэтому именно подбором организма, из которого выделяется фермент, и подбором фермента, для которого определяемое вещество является субстратом, в большинстве случаев удается найти подходящий тест-объект биосенсора, который будет работоспособным в оговоренном диапазоне температур. Однако и в данном случае возможности подбора далеко не безграничны, большинство ферментов необратимо денатурируются при нагреве их свыше 45–50 ^oС.

Зависимость каталитической активности ферментов от рН среды в некоторой степени напоминает выше рассмотренную для температуры (рис. 6). И в этом случае существует оптимальное значение кислотности среды, при которой активность фермента максимальна. Отклонение рН в кислую или щелочную область от оптимального значения резко снижает активность фермента. Значение оптимальной величины рН для каждого фермента индивидуально и колеблется в очень широких пределах. При этом ферменты, относящиеся к одному и тому же классу и катализирующие одни и те же реакции, но извлеченные из разных организмов (или разных органов одного организма), могут чрезвычайно различаться по величине оптимального значения рН. Например, протеолитические ферменты пепсин и папаин характеризуются оптимумами рН около 1,0 и 7,0 соответственно, т. е. и в этом

 

V_max

 

рН

3 4 5 6 7 8

 

Рис. 6. Зависимость максимальной скорости ферментативной

Реакции от рН

 

случае среди значительного разнообразия ферментов принципиально возможно выбрать подходящий вариант.

Ионы тяжелых металлов являются эффективными ингибиторами ферментов. Действие их на белковые глобулы проявляется по-разному. Возможна химическая модификация аминокислотных остатков, главным образом цистеина, с образованием сульфидов солей. Если остаток цистеина входит в активный центр фермента или в фрагмент молекулы, ответственный за поддержание нативной структуры глобулы белка, модификации тиольных остатков инактивирует катализатор. Наиболее универсальное ингибирующее действие ионов металлов связано с их способностью образовывать координационные связи. Как известно, входящие в активные центры ферментов нуклеофильные остатки гистидина, лизина и т. д. весьма склонны к образованию координационных связей с ионами тяжелых металлов. Наконец, ионы тяжелых металлов переменной валентности (меди, железа) катализируют окисление аминокислотных остатков. Взаимодействие ионов металлов с белковыми молекулами, как правило, протекает необратимо, поэтому самый лучший способ защиты фермента от действия этих ингибиторов заключается в удалении свободных ионов путем очистки, комплексообразования при помощи добавляемых реагентов (ЭДТА) или путем связывания в нерастворимые соли.

Механизм действия перекиси водорода до конца не выяснен; по-видимому, основная причина инактивации заключается в окислении функционально важных групп фермента.

С другой стороны, сильная зависимость величины ферментативной активности от присутствия низкомолекулярных ингибиторов в значительной мере расширяет возможности применения ферментов в аналитических целях. Во всяком случае, тест-объекты на основе ферментов могут быть использованы не только при анализе биогенных субстратов, но и для определения содержания токсических неорганических соединений, например тяжелых металлов и перекисей.

Высокая каталитическая способность и специфичность ферментов определяет их применение в качестве аналитических реагентов. Простой расчет показывает,что в условиях реакции первого порядка для превращения 99 % исходного субстрата в течение 1 мин требуется всего 0,14 мкМ фермента, обладающего «средними» каталитическими параметрами. Количество фермента может быть значительно уменьшено при использовании кинетического метода определения скорости превращения субстрата.

Использование высокоспецифичных ферментов позволяет селективно определять субстраты в присутствии других соединений. Вместе с тем ферменты с групповой специфичностью используются для обнаружения таких классов соединений, как антибиотики (пенициллиназа), токсичные гидросилированные производные бензола (полифенолоксидаза) и т. д.

В обычных методиках анализа процесс контролируется с применением одного из физико-химических способов оценки потребления, исходных реагентов или образования продуктов реакции, при этом ферменты расходуются так же, как и другие реагенты. Благодаря иммобилизации ферментов создалась возможность многократного применения биокатализаторов. На основе этих гетерогенных ферментов были созданы принципиально новые аналитические системы – биосенсоры, которые нашли широкое применение в научной практике и на производстве.

В конце данного раздела укажем основные достоинства и недостатки ферментов как тест-объектов биосенсорных устройств. К достоинствам относятся:

Высокая селективность.

2. Высокая чувствительность (обусловлена каталитической активностью ферментов).

3. Возможность подбора фермента с соответствующими техническому заданию свойствами (ферменты достаточно давно исследуются, проведена их классификация, установлены содержание и локализация многих ферментов в отдельных организмах).

Относительно низкая стоимость (хотя в целом процедуры выделения и очистки указанных препаратов достаточно трудоемки, однако налажено промышленное производство значительного числа ферментов, используемых в биотехнологическом производстве. Именно увеличение масштабов производства и дает возможность снизить их себестоимость).