Характеристики потенциометрических электродов

Определяемое вещество	Фермент	Метод иммобилизации	Электрохимический датчик	Пределы определения, М
АМФ	АМФ-деамина-за	Сорбция	Газовый NH3 электрод	10^-4–10^-2
Амигдалин	b-глюкозидаза	Включение в гель	СN^--электрод	5×10^-6–10^-3
D-амино-кислоты	Оксидаза D-аминокислот	Включение в гель	NH4^+-электрод	5×10^-5–10^-2
L-амино-кислоты	Оксидаза L-аминокислот	Ковалентная сшивка	NH4^+-электрод	5×10^-5–10^-2
Аспарагин	Аспарагиназа	Включение в гель	NH4^+-электрод	5×10^-6–10^-2
Глутаминовая к-та	Глутаматдекарбоксилаза	Сшивание бифункц. реаг.	Газовый СО2 электрод	2,7×10^-5 – 7×10^-4
Лизин	Лизиндекарбоксилаза	Сшивание бифункц. реаг.	Газовый СО2 электрод	5×10^-5–10^-1
Мочевая кис-лота	Урикиназа	Захват под целлофаном	Газовый СО2 электрод	10^-4–2,5×10^-3
Мочевина	Уреаза	Сшивание бифункц. реаг.	Газовый NH3 электрод	5×10^-5–10^-2
Мочевина	Уреаза	Сшивание бифункц. реаг.	СО2 электрод со щелью	10^-4 – 10^-2
NO3^-	Нитрат- и нитритредуктаза	Ковалентная сшивка	NH3 электрод со щелью	10^-4 – 10^-2
Пенициллин	Пенициллиназа	Включение в гель	Стеклянный рН эл-д	10^-4–5×10^-2
Тирозин	Тирозинде-карбоксилаза	Сшивание бифункц. реаг.	Газовый СО2 электрод	2,5×10^-4– 1,5×10^-3
Фенилаланин	Фенилаланин-декарбоксилаза	Сшивание бифункц. реаг.	Газовый СО2 электрод	2,5×10^-3– 1,5×10^-2

датчиком. В качестве примера можно привести создание биосенсора, чувствительного к нитрат-иону, который восстанавливается до нитрита нитратредуктазой, а затем нитритредуктаза восстанавливает нитрит-ион до аммиака.

Очевидно, в этом и подобных ему последовательных превращениях селективность системы должна уменьшаться. Такие электроды будут чувствовать не только начальные продукты, но и промежуточные. В целом не существует принципиальных ограничений для того, чтобы путем подбора ферментативных реакций создать потенциометриче-ские биосенсоры для определения многих органических и неорганических соединений.

 

Амперометрические ферментные

Электроды

Для изготовления амперометрических ферментных электродов наи-более часто используются оксидазы аминокислот и спиртов, диаминооксидаза, глюкозооксидаза, холестериноксидаза, галактозооксидаза. Эти ферменты катализируют окисление органических соединений молекулярным кислородом с образованием перекиси водорода:

 

диаминооксидаза

R-CH₂NH₂ + O₂ + H₂O R-CHO + NH₃ + H₂O₂

метанолоксидаза

CH₃OH + O₂ CH₂O + H₂O₂

 

галактозооксидаза

Галактоза + О₂ Галактозоальдегид + H₂O₂

холестериноксидаза

Холестерин + О₂ Холестенон + H₂O₂.

За ходом этих реакций можно следить как путем регистрации потребления кислорода, так и определения скорости образования перекиси водорода, поэтому ферментные электроды изготавливаются на основе кислородных и перекисных электрохимических датчиков. В реакциях фенолоксидазы перекись водорода не образуется, поэтому ферментные электроды созданы с использованием кислородных датчиков. Характеристики некоторых амперометрических биосенсоров на основе ферментов приведены в табл. 6.

В некоторых амперометрических биосенсорах применяются оксидазы, которые окисляют субстраты под действием других акцепторов электронов (М⁺). В электродах для определения молочной кислоты протекает реакция

 

цитохром b₂

СН₃СН(ОН)СОО^- + 2М⁺ СН₃СОСОО^- + 2М^* + 2Н⁺.

 

 

Таблица 6

Характеристики некоторых амперометрических ферментных электродов

 

Определяемое вещество	Фермент	Метод иммобилизации	Электрохимический датчик	Пределы измеряемых концентраций, М
L-аминокислоты	Оксидаза L-аминокислот	Ковалентная сшивка	Pt Н2О2 электрод	10^-5 – 10^-3
Биогенные амины	Диаминооксидаза	Сшивка бифункц. реагентом	Электрод Кларка	3×10^-5 - 6×10^-4
Галактоза	Галактозооксидаза	Сшивка бифункц. реагентом	Электрохимический датчик Н2О2	0 – 2,7×10^-2
Глюкоза	Глюкозооксидаза	Сшивка бифункц. реагентом	Pt Н2О2 электрод	5×10^-5 – 10^-2
«- «- «-«	«- «- «-«	Ковалентная сшивка	Электрод Кларка	10^-4 - 7×10^-3
«- «- «-«	«- «- «-«	Сорбция	Pt феррициа-нидный электрод	7×10^-3 - 2,7×10^-2
Мальтоза	Мальтаза + глюкозооксидаза	Сшивка бифункц. реагентом	Электрод Кларка	0 - 2×10^-3
Сахароза	Инвертаза + мутаротаза + глюкозооксидаза	Сшивка бифункц. реагентом	Электрод Кларка	0 - 10^-3

 

В качестве акцептора электронов наиболее часто используется феррицианид калия, окисленная форма которого легко образуется на платиновом аноде. Этот процесс и является тест-реакцией:

 

Fe(CN)₆^4- ® Fe(CN)₆^3- + e ^–.

Глюкозооксидаза катализирует процесс окисления глюкозы не только молекулярным кислородом, но и другими акцепторами электронов (феррицианид калия, хинон и др.):

Глюкоза + 2Fe(CN)₆^3- + Н₂ ®Глюконовая к-та + 2Fe(CN)₆^4- + 2Н⁺.

На этом процессе основана конструкция одного из электродов для определения содержания глюкозы.

Когда продукты или субстраты ферментативной реакции электрохимически не активны, при создании амперометрических биосенсоров применяется последовательное превращение субстратов. На этом основано действие чувствительных к дисахаридам электродов. Для определения лактозы и мальтозы используются два фермента, одним из которых является глюкозооксидаза, окисляющая глюкозу:

 

b-галактозидаза

Лактоза + Н₂О Глюкоза + Галактоза

мальтаза

Мальтоза + Н₂О Глюкоза

 

глюкозооксидаза

Глюкоза + Н₂О + О₂ Глюконовая к-та + Н₂О₂.

 

Чтобы определить сахарозу, необходим еще дополнительный фермент, который эпимеризует a-глюкозу – продукт гидролиза сахарозы – в b-форму, окисляемую глюкозооксидазой:

 

инвертаза

Сахароза + Н₂О a-D-глюкоза + Фруктоза

 

мутаротаза

a-D-глюкоза b-D-глюкоза.

 

Скорость неферментативной мутаротации высока, поэтому можно отказаться от применения мутаротазы, хотя чувствительность электрода для определения сахара при этом сильно уменьшается.

Для определения фосфата используется также последовательное превращение глюкозо-6-фосфата с образованием глюкозы, которая определяется по описанному ранее методу. Скорость ферментативной реакции замедляется при наличии в исследуемом растворе фосфата:

 

щелочная фосфатаза

Глюкозо-6-фосфат + Н₂О Глюкоза + НРО₄^2-

 

Путем соответствующего подбора ферментативных реакций в принципе можно создать ферментные амперометрические электроды, чувствительные к другим органическим соединениям и ионам.

 

Применение микроорганизмов