Оптические датчики регистрации

Тест-реакции

 

Когда говорят об оптических методах определения содержания тех или иных веществ, то подразумевается использование для измерений особенностей взаимодействия с веществом электромагнитного излучения, лежащего в ультрафиолетовой (УФ), видимой или инфракрасной (ИК) частях спектра (в диапазоне, для которого характерны длины волн от 100 нм до 16 мкм). Оптические методы анализа содержания вещества в газовой или жидкой фазах главным образом основаны на следующих явлениях: 1) поглощении излучения веществом (колориметрические и спектрофотометрические методы); 2) рассеянии излучения веществом (нефелометрические методы); 3) люминесценции вещества (спектрофлуоресцентные, хемо- и биолюминесцентные и другие методы). На основе указанных явлений и базируются различные конструкции биосенсоров. Кратко рассмотрим основные закономерности указанных явлений и особенности методик определения содержания вещества, базирующихся на их основе.

 

Колориметрические датчики

Колориметрический метод определения содержания вещества в среде основан на явлении поглощения квантов света определенной длины волны молекулами анализируемого вещества. Это наиболее старый из оптических методов оценки содержания в растворах окрашенных веществ. Степень поглощения света, проходящего через слой растворенного вещества, зависит от концентрации последнего в среде и толщины слоя. Основой этого метода являются законы Бугера–Бера и Ламберта, согласно которым зависимость отношения интенсивностей света, прошедшего через слой раствора (J) толщиной l, содержащего анализируемое вещество в концентрации С, и падающего света (J₀) на поверхность анализируемой среды определяется уравнением

 

ln(J/J₀) = D = e C× l, (23)

 

где D – коэффициент поглощения света или оптическая плотность раствора; e –молярный коэффициент экстинкции – оптическая плотность сантиметрового слоя раствора концентрации 1 моль/л.

Длина волны тестирующего пучка света должна соответствовать положению максимума поглощения в спектре поглощения анализируемого вещества. Если в спектре поглощения вещества имеется несколько максимумов поглощения света, то выбор длины волны тестирующего пучка света может определяться разными причинами: относительной величиной максимума поглощения, мешающим влиянием других веществ, возможностями осветительной и регистрирующей аппаратуры и т. п. Для повышения точности определения светопоглощения анализируемым раствором обычно колориметрию производят в дифференциальном режиме, т. е. производится сравнение интенсивностей световых пучков, прошедших через контрольную и анализируемую среды (рис. 17).

Колориметрические датчики представляют собой различного рода устройства, позволяющие регистрировать поглощение света от осветителя. Необходимым условием для функционирования таких датчиков является прозрачность среды, через которую проходит тестирующий пучок света. В этой связи возникают определенные технические

 

3

4 67

2

8

1

 

4 5 7

 

Рис. 17. Схема дифференциального фотоколориметра. 1 – осветительное устройство; 2 – светофильтр (монохроматор); 3 – разделительная призма; 4 – зеркала; 5, 6 – кюветы с контрольной и анализируемой средами соответственно; 7 – фотоприемники–преобразователи сигнала; 8 – дифференциальный усилитель-регистратор сигнала

 

трудности по иммобилизации тест-объектов и их расположению в биосенсорном устройстве.

В простейшем варианте (применительно к биосенсорам реакторного типа) колориметрический датчик представляет собой сделанную из прозрачного материала проточную кювету с двумя плоскими параллельными гранями. Вблизи одной грани располагается осветитель, у второй – фотодетектор. В более сложных устройствах возникает необходимость иммобилизации оптического индикатора и регистрации эффектов поглощения света непосредственно в анализируемой среде, что предполагает надежную электрическую и влагоизоляцию осветительного и детектирующего элементов биосенсорных устройств. В связи с этим в конструкциях оптических датчиков биосенсорных устройств нашли широкое применение свето- и фотодиоды, оптроны и другие устройства полупроводниковой микроэлектроники, кроме того, в конструкциях колориметрических датчиков применяется волоконная оптика.

Таким образом, колориметрический метод регистрации тест-реак-ции применим только в тех случаях, когда исходные реагенты, участвующие в тест-реакции, или продукты превращений, происходящих на тест-объекте, или сам тест-объект поглощают свет в видимой, ультрафиолетовой или инфракрасной частях спектра. Причем в случае колориметрического анализа по светопоглощению тест-объекта необходимо, чтобы в результате тест-реакции происходило определенное изменение оптических свойств последнего.

Выбор веществ, участвующих в биохимических процессах, концентрацию которых можно определить колориметрически, относительно невелик. Наиболее часто в биосенсорных устройствах на основе колориметрических датчиков регистрируются в качестве тест-реакции процессы окисления и восстановления НАД, ферри-ферро-цианидной системы, гемсодержащих белков и другие превращения компонентов аналитической системы, которые приводят к изменению светопоглощения.

Для расширения возможностей регистрации тест-реакции колориметрическими датчиками используются вспомогательные компоненты (колориметрические зонды) тест-системы, которые сами не участвуют в биохимических реакциях, но под воздействием продуктов последних изменяют свои оптические свойства.

В наиболее простом варианте в качестве колориметрического зонда используются кислотно-основные индикаторы, изменяющие цвет в зависимости от величины рН. Однако в большинстве конструкций биосенсорных устройств колориметрические зонды иммобилизованы. В целом принцип действия оптического датчика на основе иммобилизованных кислотно-основных индикаторов мало отличается от рН электрода. Однако при использовании индикаторов резко сужается диапазон регистрируемых одним зондом значений рН (переход цвета большинства индикаторов происходит в пределах одной единицы рН). Для расширения диапазона регистрации оправдано использование одновременно нескольких зондов. Однако в большинстве случаев этого не требуется, поскольку изменения рН при тест-реакции не превышают пределов указанной области изменений показателя кислотности, необходимо лишь подобрать такой индикатор, который «работал» бы в заданных пределах значения рН. Кроме кислотно-основных индикаторов, в качестве колориметрических зондов могут применяться окислительно-восстановительные и другие индикаторы.

В заключении раздела приведем описание функционирования некоторых колориметрических датчиков, применяемых в биосенсорных устройствах.

В подавляющем большинстве биосенсорных устройств датчики, регистрирующие тест-реакцию, компактны; по этой причине в колориметрических устройствах такого рода широко применяются оптические волокна. На рис. 18 изображена схема оптического датчика для определения содержания аммиака.

 

1 3 4 5 6

 

 

2 NH₃ + H⁺ «NH₄ ⁺

 

Рис. 18. Конструкция колориметрического датчика для определения содержания аммиака. 1, 2 – оптические волокна, соединенные с осветителем и фотодетектором соответственно; 3 – стеклянный капилляр; 4 – пробка из эпоксидной смолы; 5 – отсек датчика с растворами электролита и индикатора; 6 – тефлоновая мембрана

 

1 2 3 4

 

5 6

Рис. 19. Оптический датчик регистрации изменений рН. 1, 5 – оптические волокна соединенные с осветителем и фотодетектором соответственно; 2 – отражающе-перемешивающие сферы; 3 – сферы с иммобилизованным индикатором; 4 – пробка; 6 – избирательно проницаемая мембрана

Несложно убедиться в том, что принцип работы датчика, изображенного на рис. 18, не отличается от приципа действия газового мембранного электрода (см. рис. 12): аммиак диффундирует через тефлоновую мембрану (6) внутрь замкнутого отсека (5) датчика, в котором содержится кислотноосновной индикатор; по изменению цвета индикатора регистрируется величина рН внутри этого отсека, которая, в свою очередь, зависит от содержания аммиака снаружи датчика. Представленная конструкция датчика относительно проста, однако для ее реализации существует множество технических трудностей в плане регистрации светопоглощения. Более совершенная конструкция колориметрического датчика, регистрирующего изменения рН, приведена на рис. 19, хотя данная конструкция может быть использована для определения содержания любого другого компонента аналитической системы, лишь бы это соединение определялось с помощью иммобилизованного на сферах (3) индикатора и проникало бы внутрь датчика через мембрану (6).

Внутри датчика находятся акриловые сферы с иммобилизованными на них индикаторами. Перемешивание содержимого датчика и отражение света к фотоприемнику производится вспомогательными сферами, вращение которых осуществляется магнитным полем.

 

Флуоресцентные датчики

Люминесценция проявляется в виде свечения веществ. Это свечение обусловлено возбуждением молекул люминесцирующего вещества различными воздействиями. В том случае, когда возбуждение осуществляется светом одной длины волны, а последующее свечение проявляется через относительно короткие интервалы времени в виде свечения в более длинноволновой области спектра, чем возбуждающий свет, говорят о флуоресценции. Методы оценки концентрации веществ, в которых используется это явление, называются спектро-флуориметрическими. Методы спектрофлуориметрии позволяют определять содержание флуоресцирующих веществ. Их применение основано на взаимодействии света с веществом и возникновении при этом оптически возбужденных состояний молекул, время «жизни» которых относительно велико (превышает 10^-8 с). Эти методы практически безынерционны, обладают относительно высокой чувствительностью и обеспечивают регистрацию динамики процессов.

Спектрофлуориметрический метод основан на количественном измерении интенсивности флуоресценции объектов в определенных участках спектра. Флуоресценция (испускание света) возникает в данном случае при освещении объекта светом с длиной волны, вызывающей переход молекул в энергетически возбужденное состояние. По закону Стокса длина волны флуоресценции (l_ф) больше длины волны возбуждения (l_в). Флуоресценция наблюдается только у молекул, содержащих p-электроны.

Интенсивность флуоресценции (J _ф) зависит от концентрации флуоресцирующих молекул (С), интенсивности возбуждающего света (J _в), значения молярного коэффициента поглощения (h) и величины квантового выхода флуоресценции (q):

 

J_ф = 2,3×J_в ×h ×q ×С ×l, (24)

 

где l – длина оптического пути в объекте.

Измеряемая интенсивность флуоресценции дает информацию о величине q×С, т. е. о количестве флуоресцирующих молекул и их способности флуоресцировать (квантовый выход). Это уравнение справедливо при поглощении объектом менее 5 % возбуждающего света, что обычно имеет место в аналитических системах. При поглощении более 5 % света наблюдается нелинейная зависимость. При измерении флуоресценции необходимо учитывать светорассеяние, самопоглощение и концентрационное тушение (при высоких концентрациях флуоресцентных зондов), а также собственную флуоресценцию объекта и среды. Для характеристики флуоресценции, помимо ее интенсивности, можно использовать значение квантового выхода, смещение максимума флуоресценции по спектру, время жизни флуоресценции молекулы и степень поляризации флуоресценции.

Флуоресцирующие вещества также поглощают свет определенной длины волны. И содержание их в растворах принципиально можно определять колориметрически. Однако в большинстве случаев использование спектрофлуориметрических методов предпочтительнее, поскольку в этом случае резко увеличивается чувствительность датчика и упрощается его конструкция.

В целом круг флуоресцирующих веществ–компонентов или продуктов биохимических процессов, происходящих с участием ферментов, антител, клеток и т. п., невелик. Наиболее часто в флуоресцентных датчиках определяется содержание НАДН и еще нескольких биомолекул. Для расширения спектра регистрируемых флуориметрическим датчиком процессов, как и при использовании колориметрических датчиков, применяются различного рода флуоресцентные зонды. Да и конструкции флуоресцентных датчиков практически не отличаются от схем, приведенных на рис. 18–19, применяемых для колориметрических датчиков. Однако при использовании для аналитических процедур явления флуоресценции датчик, изображенный на рис. 19, упрощается за счет использования одного оптического волокна и для возбуждения, и для регистрации флуоресценции.

 

Хемолюминесцентные зонды

Помимо конструкций спектрофлуориметрических датчиков, явление люминесценции используется в хемолюминесцентных детекторах, отличающихся высокой чувствительностью регистрации микроколичеств определяемого соединения. Так, анализаторы глюкозы на основе глюкозооксидазы и хемолюминесцентного датчика позволяют определять углевод при его содержании в анализируемой пробе менее 10^-8 М, в то время как нижний предел концентраций глюкозы, определяемый ферментными электродами, превосходит 10^-6 – 10^-5 М.

Основой хемолюминесцентного метода является реакция, в ходе которой генерируется свет. Поскольку методы измерения интенсивности света обладают высокой чувствительностью, этим способом удается определить наномолярные концентрации соединений. Для функционирования хемолюминесцентных датчиков необходимы специфические соединения (хемолюминесцентные зонды), превращение которых в присутствии продуктов (или исходных реагентов) в ходе биохимической реакции генерирует свечение. Многие органические соединения, окисляясь кислородом или другим окислителем, могут генерировать свечение. Однако высокий квантовый выход хемолюминесценции известен лишь в двух типах химических превращений, причем в обеих реакциях участвует перекись водорода, поэтому метод применим для тех тест-процессов, продуктом реакции которых (или исходным реагентом) и является этот окислитель.

В реакциях 1-го типа свечение генерируется при взаимодействии перекиси водорода с люминолом (5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-дион):

 

люминол + Н₂О₂ ® продукты окисления + N₂ +hn.

 

Реакция протекает в щелочной среде, ионы металлов переменной валентности ее ускоряют. Наилучшим активатором процесса служит феррицианид калия в концентрации 10^-2 М. Свечение усиливается при наличии ароматических соединений, таких, как перилен, производные антрацена и другие, поскольку эти соединения обладают высоким квантовым выходом флуоресценции и электронными уровнями, близкими к уровню возбуждения продуктов окисления люминола. В этой системе при оптимальных условиях удается определять Н₂О ₂ в концентрации 10 нМ и более.

При использовании биосенсоров на основе такого зонда для анализа биологических жидкостей следует помнить, что мочевая кислота и другие соединения, находящиеся, например, в плазме крови, быстро реагируют с перекисью водорода, искажая результаты измерений. Кроме того, неопределенный состав плазмы и микропримеси ионов металлов мешают определению глюкозы таким методом в биологических образцах.

Другая хемолюминесцентная система на основе арилоксалатов ме-

нее чувствительна к действию примесей. Процесс окисления арилоксалатов протекает по схеме:

 

R-OCOCO-OR + H₂O₂ ® R-OCOCO-OOH + R-OH

O – O

| |

R-OCOCO-OOH ® O=C – C=O + ROH

O – O

| |

O=C – C=O + A ® A* + 2CO₂; A* ® A + hn,

где А – акцептор возбуждения. Свечение наблюдается в интервале от рН 4 до рН 10. В присутствии ароматических флуоресцирующих веществ как акцепторов возбуждения реакцию ускоряют небольшие количества аминов.

При использовании в качестве арилоксалата бис-(2,4,6-трихлорфе-нил)-оксалата, а в качестве акцептора возбуждения перилена интенсивность свечения линейно зависит от концентрации перекиси водорода в интервале 7×10^-8–10^-3 М. Анализатор глюкозы с использованием этой хемолюминесцентной системы обладает хорошей воспроизводимостью при концентрациях углевода 0,7–8 мкМ. В отличие от люминола мочевая кислота слабо влияет на свечение, поэтому анализатор вполне пригоден для определения глюкозы в плазме крови. Биосенсор, построенный на основе этого же арилоксалата и 9,10-дифенил-антрацена (акцептор возбуждения), для обнаружения холестерина имеет чувствительность на пять порядков более высокую, чем аналогичный ферментный электрод.

 

Биолюминесцентные датчики

 

Наряду с явлением хемолюминесценции в биосенсорах используется и биолюминесценция – свечение (in vivo или in vitro) при протекании биохимических превращений. Свечение свойственно многим живым организмам, принадлежащим к различным таксономическим группам. При конструировании биосенсорных устройств применяются различные варианты протекания (in vivo или in vitro) процесса биолюминесценции. Однако наиболее привлекательны люцеферинлюцеферазные системы. Интерес к этим системам очевиден, поскольку с их помощью удается обнаружить микроколичества таких соединений, как АТФ или НАДФ.

Основой высокочувствительных систем обнаружения АТФ является реакция окисления люцеферина (LH₂) в присутствии люцеферазы (E_L) из светляков:

 

E_L + LH₂ + ATФ «E_L× LH₂–AMФ + Ф–Ф

E_L× LH₂–AMФ + O₂ ® E_L + P_ox + AMФ + CO₂ + hn,

где P_ox – продукт реакции окисления – оксилюциферин. В этой реакции генерируется свет с длиной волны 550–650 нм. Реакция окисления люциферина исключительно специфична относительно АТФ. Используя указанную реакцию можно определять содержание АТФ в интервале концентраций от 10 до 1000 нМ с точностью до 7 %.

Для реакций с участием бактериальной люцеферазы АТФ не требуется. Фермент катализирует окисление восстановленного флавинмононуклеотида (ФМН×Н₂) в присутствии альдегидов с алифатическими гидрофобными радикалами. В этом процессе альдегиды превращаются в кислоты. Генерируемый свет обладает максимумом при 495 нм:

 

ФМН×Н₂ + E_L^б ® E_L^б– ФМН×Н₂

E_L^б– ФМН×Н₂ + RCHO + O₂ ® RCHOOH + ФМН + H₂O + E_L^б + hn.

 

Из-за быстрого окисления восстановленного ФМН реакция вне микроорганизмов быстро прекращается. Восстановление ФМН in vitro может быть осуществлено под действием НАДН или НАДФН в присутствии ФМН-редуктазы:

 

ФМН + НАДН + Н⁺ ® ФМН×Н₂ + НАД.

 

Необходимо отметить, что датчики на основе бактериальной люциферазы могут быть использованы для определения ФМН, НАД и НАДФ. Нижний предел чувствительности датчика к НАДН оценивается в 10 нМ, что в количественном отношении соответствует 10^-12 моля указанного нуклеотида. Биолюминесцентные датчики на основе люцифераз представляют собой устройства, содержащие иммобилизованные ферменты (или бактерии), работающие совместно с детектором излучения. В определенном смысле такие датчики уже сами по себе являются биосенсорными устройствами, поскольку могут быть напрямую использованы для определения содержания АТФ, ФМН или НАД (НАДФ).

В конце раздела, посвященного оптическим датчикам тест-реакции, укажем на основные их преимущества и недостатки. К преимуществам оптических датчиков перед электрохимическими относятся следующие моменты:

1. В датчиках отсутствует электрод сравнения (хотя зачастую требуется сравнение показаний датчика с эталонным источником света).

2. Датчики напрямую не подвержены влиянию электромагнитных полей.

3. Иммобилизованные компоненты не обязательно должны непосредственно контактировать с поверхностью датчика, поэтому тест-объект может быть относительно легко заменен в случае его повреждения.

4. Возможность использования одного датчика для регистрации разных тест-реакций (в самом простом случае – оценка концентрации одного и того же продукта, например, колориметрически по двум максимумам поглощения; в более сложном варианте – определение с помощью одного и того же датчика различных соединений – продуктов реакции).

5. Считается, что оптические методы измерения тест-реакции имеют гораздо больший потенциал информативности, чем электрохимические, поскольку с их помощью можно оценить состояние тест-объекта комплексно.

Недостатки оптических датчиков следующие:

1. Они пригодны для регистрации ограниченного круга веществ, обладающих определенными оптическими свойствами.

2. Требуют экранирования от фоновых источников освещения.

3. Имеют ограниченный по сравнению с электрохимическими датчиками диапазон определяемых концентраций (например, переход цвета большинства кислотноосновных индикаторов осуществляется в пределах 1–2 ед. рН, в то время как с помощью стеклянного электрода показатель кислотности определяется в пределах от рН 0 до рН 14).

4. Пределы миниатюризации датчиков ограничены.

5. Под действием света многие реагенты и тест-объекты инактивируются.

6. В целом по быстродействию (скорости установления стационарных показателей при смене концентрации анализируемого вещества) оптические датчики уступают электрохимическим.

 

Термометрические датчики

Тест-реакции

Ферментативные реакции, как и любые химические процессы, сопровождаются изменением энтальпии (Н): одни процессы протекают с поглощением тепла (DН > 0), другие – с выделением (DН < 0). Однако изменение энтальпии большинства ферментативных реакций невелико. Тем не менее тепловые эффекты многих биохимических процессов могут выступать в качестве тест-реакции, поскольку суммарное изменение энтальпии процесса пропорционально содержанию исходных компонентов реакционной смеси. Процедура регистрации тепловых эффектов сводится к измерению температуры.

В термометрических датчиках регистрация тепловых эффектов обычно производится термисторами, контактирующими с тест-объектом. Однако ввиду малости тепловых эффектов изменения температуры под действием биохимических процессов крайне невелики. Поэтому даже малые флуктуации температуры окружающей среды в значительной мере снижают точность регистрации теплового эффекта реакции. В этой связи зачастую в термометрических датчиках для компенсации изменения температуры внешней среды применяется дополнительный термистор, который не контактирует с тест-объектом. Изменения температуры в этом случае фиксируются дифференциальным способом как разность в показаниях термисторов. Насколько велика должна быть чувствительность термодатчиков можно продемонстрировать на примере процесса окисления глюкозы в присутствии глюкозооксидазы: при концентрации глюкозы в растворе выше чем 2 мМ изменение температуры (в отсутствие термоизоляции измерительной ячейки) составляет около 2×10^{-4 о}С. Между тем энтальпиметрические биосенсоры позволяют определять и более низкие концентрации глюкозы. По этой причине термометрические датчики представляют собой адиабатические миниреакторы. В отличие от сложных микрокалориметров теплота, выделяющаяся в миниреакторах, измеряется термисторами – полупроводниковыми сопротивлениями небольших размеров, обладающими высоким температурным коэффициентом. Это значительно упрощает и удешевляет систему. В аналитических системах используются термисторы с сопротивлением 2–150 кОм при 25 °С и с температурным коэффициентом от минус 3 до минус 5 %/град. Такими термисторами могут быть определены изменения температуры менее 0,001 ^оС.

Термометрические датчики могут быть сделаны в виде проточных адиабатических колонок. В этом случае процесс измерения тепловыделения производится путем определения разности температуры пробы на входе и выходе миниреактора. Например, простой энтальпиметрический биосенсор для определения концентрации мочевины на основе иммобилизованной уреазы представляет собой колонку длиной 2,5 см и внутренним диаметром 0,5 см, изготовленную из дьюаровской трубки. Трубка заполнена иммобилизованной на пористом стекле уреазой.

Термометрические датчики могут быть использованы для создания биосенсорных устройств на основе иммобилизованных ферментов, антител (антигенов), клеток и т. д.