Методы регенерации пиридиновых

Коферментов

 

Ферментативный метод регенерации является естественным процессом, протекающим в живых клетках. Пиридиновые коферменты выполняют роль переносчика окислительно-восстановительных эквивалентов, регенерация их вне организма осуществляется другим ферментом.

В ферментативных реакциях с участием дегидрогеназ (схема приведена выше) положение равновесия сильно сдвинуто в сторону образования продуктов реакции, так как восстановительный потен-циал (Е_од)пары НАД(Ф)Н/НАД(Ф) отрицателен (Е_од = минус 0,32 В). Соотношение концентраций окисленной и восстановленной форм коферментов после установления равновесия определяется равновес-ным потенциалом системы в целом.

В восстановительном регенеративном процессе НАД(Ф), образую-щийся в основной реакции, восстанавливается другим субстратом с участием другого фермента. В качестве такого фермента широкое распространение получила алкогольдегидрогеназа, что объясняется легкостью удаления продукта ферментативной реакции – ацетальдегида. В качестве других ферментов используются глутаматдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа в присутствии соответсвующего субстрата – глутаминовой кислоты, лактата и глюкозо-6-фосфата. Принципиально возмжно для регенерации использовать и любые другие системы ферментов и субстратов.

Ферментативная регенерация осуществляется с высокой скоростью. Применяя лактатдегидрогеназу или алкогольдегидрогеназу, можно дость скорости превращений НАД до 30 000 циклов в час. При использовании этого процесса для определения содержания НАД достигается «химическое усиление сигнала» в 10⁶ раз, что обеспечивает принципиальную возможность определять пикомолярные концентрации кофермента. Однако в реальных аналитических системах требуется иммобилизация коферментов, что резко снижает скорость их регенерации. Так, при микрокапсулировании НАД указанные выше ферменты регенерировали кофермент со скоростью лишь 20 циклов в час. Применение других способов иммобилизации несколько увеличивает скорость регенеративных процессов.

Принципиально возможна как окислительная, так и восстановительная ферментативная регенерация. Причем наиболее эффективно эти процессы протекают внутри нативного организма. В регенеративных процессах, протекающих в клетках, коферменты совершают огромное число превращений (около 1 млн оборотов), не теряя активности. Теоретически возможно создание подобной системы с использованием ферментов и вне организма.

Способность химического соединения окислять или восстанавливать коферменты является основой химической регенерации НАД(Ф). В подавляющем большинстве случаев происходит окислительная регенерация, в которой окислителями могут быть как одноэлектронные, так и двухэлектронные акцепторы, причем во втором случае окисление протекает быстрее. Наиболее энергичными окислителями являются феназинметасульфат и тиазолил синий, менее активен метиленовый синий, еще слабее – рибофлавин, сафранин и 2,6-дихлорфенолиндофе-нол. Облучение акрифлавина и рибофлавина светом увеличивает акцепторные свойства красителей, поэтому в электронно-возбужденном состоянии скорость окисления возрастает более чем на порядок.

R₂ R₂

^·N–R1

^+N–R1

e^-

H– H–

e^- + H⁺

R₂

H R₂ H R₂

N–R1

R1–N

N–R1

H H

 

Рис. 21. Электрохимическое превращение никотинамидных коферментов

 

При изготовлении биосенсоров требуется иммобилизация регенерирующих агентов. В подавляющем большинстве случаев она осуществляется путем ковалентной сшивки с носителем. Показано, что такая процедура незначительно сказывается на окислительных способностях многих соединений.

При химическом способе принципиально возможна как окислительная, так и восстановительная регенерации. Причем скорости процессов окислительной регенерации вполне сравнимы с таковыми при использовании ферментных систем и принципиально возможно проведение 10⁴ циклов регенерации без потери активности кофермента. Эффективность восстановительной регенерации несколько ниже, однако и в этом случае вполне достигается 99 % обратимости процесса.

В основе электрохимической регенерации пиридинамидных коферментов лежит реакция электрохимического окисления или восстановления НАД(Ф)Н или НАД(Ф) соответственно.

В водной среде электровосстановление протекает в две стадии (рис. 21). Первый одноэлектродный перенос обратим и не зависит от рН. В результате переноса электрона образуется радикал НАД(Ф)*, который может быстро и необратимо димеризоваться. Образующийся димер полностью неактивен в реакциях со многими дегидрогеназами. Вторая стадия восстановления НАД(Ф) необратима и зависит от рН.

Путем подбора условий электролиза можно свести к минимуму образование ферментативно неактивного димера. Однако и при выходе 10 % димера после 10 оборотов кофермент превращается в неактивную форму, поэтому для создания систем с восстановительным электрохимическим регенерированием необходима разработка методов двухэлектронного восстановления, минуя стадию образования радикала. Существенного замедления димеризации можно добиться путем пришивки НАД к водорастворимым полимерам. В этом случае из-за замедленной диффузии радикалы быстрее восстанавливаются, чем димеризуются.

Сравнительные характеристики различных методов регенерации никотинамидных коферментов приведены в табл. 7.