В электрохимических биосенсорах

Стабильность аналитических систем на основе иммобилизованных ферментов определяется в основном устойчивостью биокатализаторов. Многие клеточные ферменты, однако, являются весьма лабильными и неустойчивыми белками. Аналитические системы, созданные на основе этих биокатализаторов, обладают непродолжительным временем действия. Интактные клетки микроорганизмов содержат все ферментативные системы, необходимые для их жизнедеятельности. Они с высокой эффективностью преобразуют химическую и другие формы энергии, обладают необходимой стабильностью и регенеративностью. В клетках происходят превращения субстрата под действием полиферментных комплексов и систем, в которых участвуют коферменты. В связи с этим представляет интерес разработка методов, позволяющих сопрягать в аналитических системах клеточные ферментативные реакции с электродными процессами.

Существует ряд принципиальных возможностей использования микроорганизмов для аналитических целей. Вещества, влияющие на жизнедеятельность микроорганизмов, могут привести к изменению скорости выделения тепла или другой функции, например скорости дыхания, генерации мембранного потенциала и т. д. В других случаях индуцируется определенная ферментативная система, которая в клетках микроорганизмов может действовать подобно ферменту в микрокапсулах. Специфичность такого микро-реактора определяется ферментативной реакцией и проницаемостью клеточных мембран. В электрохимических микробных биосенсорах клетки микроорганизмов захватываются на поверхности потенциометрических (ионоселективных или газовых) или амперометрических электродов. Под действием определенных ферментативных систем клеток субстраты трансформируются в продукты, которые и определяются электрохимическим датчиком, либо определение ведется по скорости потребления кислорода.

В селективном относительно аргинина биосенсоре применены клетки микроорганизмов Streptococcus faecium,которые широко используются для микробиологического определения аминокислот. В клетках микроорганизмов L-аргинин превращается в ионы аммония под действием следующих ферментативных реакций:

аргининдеаминаза

аргинин цитруллин + NH₃

орнитинтранскарбомилаза

цитруллин+H₃PO₄ орнитин+карбамоилфосфат

карбамоилаткиназа

карбамоилфосфат+АДФ карбамоиловая к-та+АТФ

карбамоиловая к-та ® СО₂ + NH₃.

Ионы аммония в больших количествах образуются только из аргинина, поэтому можно ожидать высокой селективности биосенсора относительно этой аминокислоты. Внеклеточный цитруллин не дает ионов аммония, так как клеточные мембраны для него непроницаемы.

Преимуществом бактериальных биосенсоров является возможность их регенерации. После 20-дневной эксплуатации и выдерживания в питательной среде в течение 2 суток, биосенсоры полностью восстанавливают свои параметры.

Чувствительный к аспартату биосенсор изготовлен на основе клеток Bacterium cadaveris и газового NH₃ -электрода. В клетках микроорганизмов аспартат метаболизируется следующим образом:

 

аспартаза

аспартат фумарат + NH₃.

Аспартаза – весьма нестабильный фермент. Электрод, изготовленный на основе очищенного фермента, инактивируется в течение 1 суток. Добавлением дитиотреитола к среде хранения бактериального электрода можно увеличить время его службы до 10 суток. Стабильность этого биосенсора значительно возрастает при выдерживании его в питательной среде, в которой ферментный электрод не восстанавливается. Эти данные свидетельствуют о регенерируемости бактериальных биосенсоров.

Наличие в большинстве клеток микроорганизмов деаминаз аминокислот и других органических соединений сильно уменьшает селективность микробных сенсоров на основе аммонийного электрода. Однако замена аммиачного датчика на другой иногда позволяет обойти этот недостаток. Например, с использованием бактерий Proteus morganium, которые катализируют превращение цистеина, и газового H₂S -электрода изготовлен селективный биосенсор для определения цистеина:

 

цистеиндесульфгидраза

цистеин пируват + NH₃ + H₂S.

Облигатные или факультативные аэробные микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности потребляют кислород. Это их свойство использовано при создании ряда микробных сенсоров для определения концентрации органических соединений, биологическое окисление которых протекает с потреблением кислорода. Кроме того, так называемая биохимическая потребность в кислороде является параметром, характеризующим степень загрязнения воды органическими соединениями. Таким образом, биосенсоры, основанные на явлении потребления кислорода микроорганизмами, могут использоваться как для определения содержания конкретных веществ (в этом случае используются определенные бактерии или отдельные штаммы их), так и для контроля качества воды (по потреблению кислорода, обусловленному наличием целого ряда различных органических соединений).

4.3.. Физико-химические основы регистрации иммунных реакций электрохимическими

Датчиками

 

Результатом совершенствования иммунного анализа явилась разработка иммуноферментного анализа (ИФА). Способность ферментов эффективно катализировать химические реакции позволяет осуществлять их регистрацию в концентрациях, сравнимых с концентрацией изотопных меток. В последнее десятилетие интенсивно развивался новый подход, основанный на комбинировании ферментов с антителами и применении электрохимических преобразователей для оценки реакций связывания антиген-антитело. В качестве электрохимических преобразователей используются амперометрические (электрод Кларка) и потенциометрические датчики.

Принцип работы амперометрического иммуноферментного электрода можно рассмотреть как вариант конкурентного ИФА. Для тестирования антигена соответствующие антитела иммобилизуют на мембрану-носитель. При наличии в растворе антигенов они будут с высокой специфичностью связываться антителами на поверхности мембраны. Если определяемые антигены связываются с иммобилизованными антителами в присутствии меченых антигенов, места связывания будут заполняться как мечеными, так и тестируемыми антигенами в пропорции, определяемой соотношением их концентраций. Когда в качестве метки используется какой-либо фермент, например каталаза, разрушающая перекись водорода, концентрацию антигенов, меченых каталазой, можно оценить по скорости появления кислорода в среде с известным содержанием Н₂О₂. Обычно ферментные иммунобиосенсоры изготавливают путем размещения мембраны, содержащей антитела, на поверхности пластиковой мембраны, проницаемой для О₂ и расположенной на катоде электрода Кларка, который позволяет быстро и чувствительно определять изменение концентраций кислорода либо перекиси водорода в среде.

Потенциометрический иммуносенсор, аналогично амперометрическому, содержит мембрану с иммобилизованными антителом или антигеном. Образование комплекса антиген-антитело приводит к появлению мембранного потенциала, который измеряется регистрирующим устройством. Принципиальное отличие амперометрического метода измерения от потенциометрического состоит в том, что в первом случае регистрируется ток, который пропорционален концентрации определяемого вещества при фиксированном потенциале электрода, во втором – потенциал, который пропорционален логарифму концентрации вещества, при этом ток через мембрану отсутствует.

В настоящее время большое практическое распространение получили косвенные методы потенциометрического тестирования иммунных реакций. В этих методах тестирование опосредовано применением ферментных меток, либо использованием липосом с электроактивным наполнением, либо применением белков, конъюгированных с ионофорами. Перечисленные варианты практически полностью охватывают все разнообразие косвенных потенциометрических методов, используемых в настоящее время в иммунобиосенсорах. Использование мембран, содержащих ионофоры, позволяет производить косвенное потенциометрическое тестирование иммунных реакций. Суть метода достаточно проста и состоит в следующем. Пусть имеется гаптен и соответствующее ему антитело, подлежащее определению. Для реализации метода гаптен ковалентно связывают с каким-либо ионофором, формируя конъюгат гаптен-ионофор. Конъюгат встраивается в полимерную мембрану, которая является чувствительным элементом соответствующего потенциометрического электрода. При измерениях электрод находится в растворе с постоянной активностью маркерного иона, соответствующего данному типу ионофора. В этом случае на электроде устанавливается стабильный и воспроизводимый потенциал. При добавлении в раствор антител, способных связываться с гаптеном конъюгата, на электроде возникает разность электрических потенциалов, пропорциональная концентрации антител. Для такого биосенсора можно получить калибровочную кривую, устанавливающую зависимость величины разности потенциалов от концентрации антител в растворе или, используя принцип конкурентного взаимодействия, от концентрации гаптена в растворе.

Указанный метод применялся для определения концентрации антитела к дигоксину, сердечному препарату стероидной природы. Использовали краун-эфиры как ионофоры, которые при растворении легко вводились в поливинилхлоридную матрицу-носитель и обеспечивали высокую селективность к ионам калия. Потенциометрический датчик состоял из поливинилхлоридной мембраны, размещенной в торце стеклянной трубки. В материал мембраны при ее изготовлении вводился конъюгат дигоксина и краун-эфира. Стабильность такой мембраны была высокой и ее активность сохранялась не менее 6 месяцев при 4 ^оС.

Показано, что величина изменения потенциала электрода в ответ на введение антител определяется концентрацией маркерного иона и составляет 10 и 20 мВ при концентрации антител 19 и 7,9 мкг/мл соответственно. Добавление антител в измерительную ячейку, содержащую мембрану без конъюгата, не вызывало никаких изменений потенциала, поскольку для антител в такой мембране не существовало мишеней для связывания.

Согласно теоретической модели биосенсора, потенциал мембраны изменяется вследствие взаимодействия антител раствора с антигенами, конъюгированными с ионофором и встроенными в мембрану. При связывании конъюгата с антителом первый перестает работать как ионофор, что, в свою очередь, приводит к изменению ионообменных процессов на электрохимическом датчике.

Описанный метод определения антигенов и антител позволяет просто и с высокой точностью производить иммунохимический анализ. Так, чувствительность по определению антител лежит в диапазоне мкг/мл, а антигены можно определять при их содержании от 10 нМ до 1 мкМ.

В электрохимическом тестировании иммунных реакций постоянное внимание уделяется совершенствованию методологии ионоселективных электродов. Наиболее распространенными типами ионоселективных электродов, применяемыми в иммунобиосенсорах, являются электроды, предназначенные для определения ионов серебра, фтора, йода, аммония, а также газовых компонентов, например двуокиси углерода. Общий принцип тестирования с помощью ионоселективных электродов состоит во введении в набор реагентов метки, изменяющаяся концентрация которой регистрируется в процессе иммунной реакции.

Например, использование ионоселективного датчика в виде F^-- се-лективного электрода имеет ряд преимуществ перед другими потенциометрическими датчиками, поскольку электроды, определяющие концентрацию фторид-иона, не чувствительны к компонентам биологических жидкостей. Принцип же работы такого биосенсора основывается на процессе катализа пероксидазой окисления р -фторанилина перекисью водорода. Одним из продуктов этой реакции является ион F^-, который и определяется датчиком. Пероксидаза выступает как метка, а в анализируемую пробу вводятся р -фторанилин и перекись водорода в заданных концентрациях.

Идея прямого потенциометрического иммунотестирования базируется на предположении, что антигены и антитела в водных растворах представляют собой полиэлектролиты, и их электрический заряд будет изменяться при связывании. Поэтому разность потенциалов между измерительным электродом, на котором иммобилизованы, например, антитела, и электродом сравнения должна зависеть от концентрации свободных антигенов в растворе. Разность потенциалов на мембране измерительного электрода зависит от концентраций ионов по обе стороны мембраны, плотности зарядов в мембране, проницаемости мембраны. Кроме того, вклад в потенциал электрода вносят поверхностный и диффузионный потенциалы. При низкой концентрации электролита поверхностный потенциал, обусловленный комплексом антиген-антитело, может играть доминирующую роль. В целом идея прямого потенциометрического иммунотестирования до конца не реализована, поскольку для разработки надежных аналитических систем требуется найти варианты идеально поляризуемых поверхностей. Иммунобиосенсоры на основе прямого тестирования потенциала можно создать при наличии у поляризуемой поверхности крайне высокого, порядка 6×10⁷ ом×см², сопротивления переноса зарядов.