Качественное определение «прямого» и «непрямого» билирубина в сыворотке крови

Билирубин образуется в организме в результате распада гемоглобина эритроцитов в клетках ретикуло-эндотелиальной системы (печень, селезенка). Из тканей билирубин поступает в кровь, и как соединение токсичное захватывается печенью, где и обезвреживается путем соединения его с глюкуроновой кислотой, образуя моно- и диглюкурониды. Транспортируется билирубин к месту обезвреживания в комплексе с белком.

В сыворотке крови содержится два вида билирубина: нерастворимый «непрямой» (в виде комплекса с белками, обеспечивающими транспорт) и растворимый «прямой» (диглюкуронид билирубина). Вместе обе формы составляют общий билирубин.

Принцип метода. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфоновая кислота, которая дает со связанным билирубином (хорошо растворимым в воде) розово-фиолетовое окрашивание, а «непрямой» билирубин, в присутствии спирта (спирт переводит «непрямой» билирубин в растворимое состояние) – красно-розовое.

 

Исследуемый материал и реактивы

1. Сыворотка крови. 2. Диазореактив (свежеприготовленный). 3. Этиловый спирт. 4. Фильтровальная бумага.

Ход работы

А) Обнаружение «прямого» билирубина. На часовое стекло, под которое подложен лист белой бумаги, наносят каплю сыворотки крови, содержащей «прямой» билирубин, добавляют 3 капли свежеприготовленного диазореактива и перемешивают стеклянной палочкой. Образуется характерное для билирубина розово-фиолетовое окрашивание.

Б) Обнаружение «непрямого» билирубина. В пробирку отмеривают 1 мл сыворотки крови, 2 мл этилового спирта и фильтруют. К фильтрату добавляют 5 капель свежеприготовленного диазореактива – появляется красно-розовое окрашивание.

 

Указания к оформлению лабораторной работы

В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты и сделайте выводы.

 

Контрольные вопросы

1. Где и из чего в организме человека образуется билирубин?
2. Что означают термины «прямой» и «непрямой» билирубин?
3. Каким путем билирубин выделяется из организма человека?

 

Лабораторная работа №28

Количественное определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови

В крови билирубин содержится в небольших, но постоянных количествах: 8-20 мкмоль/л. В сыворотке крови содержатся две формы билирубина – связанный, или билирубинглюкуронид, хорошо растворимый в воде, и несвязанный, или свободный билирубин, плохо растворимый в воде. Свободная форма его циркулирует в крови в виде комплекса с альбумином. У здоровых людей 75% общего билирубина сыворотки крови составляет свободный билирубин.

В клинической практике чаще всего приходится встречаться с гипербилирубинемиями различного происхождения. Повышение уровня свободного билирубина в крови встречается при гемолитических желтухах, некоторых анемиях, желтухе новорожденных и др. Желтухи, связанные с затруднением оттока желчи (механические), сопровождаются повышением уровня глюкуронида билирубина («прямой»). При паренхиматозных желтухах наблюдается также повышение содержания глюкуронида билирубина, с преобладанием однако моноглюкуронида.

Принцип метода. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива свободный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он вызывает розово-фиолетовое окрашивание раствора со смесью диазореактивов. По интенсивности окрашивания последнего фотометрически определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между содержанием общего и связанного билирубина находят количество свободного.

 

Исследуемый материал и реактивы

1. Сыворотка крови. 2. Диазореактив I. 3. Диазореактив II. 4. Кофеиновый реактив. 5. Физиологический раствор хлорида натрия.

 

Ход работы

Перед работой готовят диазосмесь: смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II. В три пробирки (1 – для определения уровня общего билирубина, 2 – связанного билирубина и 3 – контрольной пробы на цвет сыворотки) вводят реактивы согласно схеме:

 

Реактив, мл	Общий билирубин	Конъюгированный (связанный) билирубин	Контрольная проба
Сыворотка	0,25	0,25	0,25
Кофеиновый реактив	1,75	–	1,75
Физиологический раствор	–	1,75	1,75
Диазосмесь	0,25	0,25	–

 

При определении уровня общего билирубина пробу оставляют при комнатной температуре на 20 мин для развития окраски. В дальнейшем окраска пробы не изменяется. Для установления содержания коньюгированного (связанного) билирубина колориметрирование осуществляют спустя 5–10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии пробы в реакцию вступает свободный билирубин.

Колориметрируют опытные пробы против контроля при зеленом светофильтре (500–560 нм) в кювете шириной 5мм. Оценку результатов производят по калибровочному графику. В норме концентрация общего билирубина в плазме (сыворотке) крови составляет 8,55-20,52 мкмоль/л, 75% его количества приходится на долю свободного билирубина.

 

Калибровочный график для определения билирубина крови

 

 

Указания к оформлению лабораторной работы

В таблицу показателей норм основных клинико-биохимических исследований впишите нормальные значения концентрации билирубина в крови.

В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты – концентрации общего и конъюгированного билирубина и сделайте выводы о причинах возможного отклонения этих показателей от нормы в исследуемом материале.

 

Контрольные вопросы

1. Назовите нормальную концентрацию билирубина в крови человека.
2. Перечислите причины гипербилирубинемии.
3. Для каких целей в клинике определяют количественное содержание билирубина в крови человека?

 

Лабораторная работа №29