Измерение коэффициента пропускания.

2.1. В световой пучок поместить кювету с растворителем или контрольным раствором, по отношению к которому производятся измерения.

2.2.Закрыть крышку кюветного отделения.

2.3.Ручками ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ и УСТАНОВКА 100 ГРУБО и ТОЧНО установить отсчет 0 по шкале колориметра. Ручка ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ может находиться в одном из трех положений: «1», «2» или «3».

2.4. Затем поворотом ручки кювету с растворителем или контрольным раствором заменить кюветой с исследуемым раствором.

2.5. Снять отсчет по шкале колориметра, соответствующий коэффициенту пропускания исследуемого раствора в единицах оптической плотности.

 

Разделение белков сыворотки методом электрофореза на бумаге

В клинических лабораториях наиболее распространены электрофоретические методы исследования белкового спектра плазмы (сыворотки) крови.

Принцип метода. Метод основан на том, что под влиянием постоянного электрического поля белки сыворотки, обладающие электрическим зарядом, движутся по смоченной буферным раствором бумаге со скоростью, зависящей от величины заряда и молекулярного веса частиц. Вследствие этого белки сыворотки разделяются обычно на 5–7 фракций: альбумины и глобулины α₁, α₂, β и γ, содержание которых определяется фотометрически. Относительное содержание белковых фракций в сыворотке крови здорового человека выражается следующими цифрами: Альбумины – 52–65%; глобулины – 29–54%: α₁-глобулины – 2-5%, α₂-глобулины – 7-13%, β-глобулины – 8-14%, γ-глобулины – 12-22%.

 

Исследуемый материал и реактивы

1. Сыворотка крови. 2. Буферный раствор. 3. Хроматографическая бумага. 4. Краситель амидо черный 10 В. 5. Раствор уксусной кислоты (2%). 6. Раствор гидроксида натрия (0,1н).

Ход работы

Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови.

Полоска хроматографической бумаги пропитывается буферным раствором, концы полоски опускаются в кюветы с буферным раствором, а в кюветы помещают электроды — катод и анод. В средней трети бумажной полоски поперек на полосу на линию старта наносят исследуемую сыворотку и включают электрический ток. Через определенное время ток выключают и бумажку подсушивают при 90⁰С (при этом белки подвергаются денатурации и фиксируются на бумаге). Далее фракции нужно проявить.

Окраска электрофореграмм.

Фиксированные полосы помещают в кювету с краской (амидо черный 10 В) и оставляют там на 15–20 минут. Для удаления избытка краски бумажные полоски переносят в кювету с 2% раствором уксусной кислоты. Через 5–10 минут кислоту сливают и полоски заливают чистым раствором уксусной кислоты. В результате такой обработки синие пятна, соответствующие различным фракциям белков, отчетливо видны на белом фоне. Полученные электрофореграммы сушат на воздухе.

Количественная оценка электрофореграмм.

В 5 пробирок наливают из бюретки по 5мл 0,1н. NаОН. Вырезают ножницами участки электрофореграммы, соответствующие каждой фракции, помещают в пронумерованные пробирки со щелочью. В качестве контроля берут неокрашенный участок бумажной полоски шириной 3–10 мм. Пробирки осторожно встряхивают и оставляют на 30–60 минут для полного извлечения краски из бумаги. Затем определяют оптическую плотность каждого раствора на фотоэлектроколориметре (кювета 10 мм, красный светофильтр с длиной волны = 670 нм). Зная оптические плотности растворов, соответствующие каждой фракции, вычисляют сумму оптических плотностей всех фракций и выражают относительное содержание белка в каждой фракции. Например:

 

Е_альбум =, Е_{α1-глобул} =, Е_{α2-глобул} =, Е_{β-глобул} =, Е_{γ-глобул} =, Σ =.

 

% =, % =, % =, % =, % =.

 

Метод сахарной нагрузки

Углубленное изучение углеводного обмена производится методом сахарной нагрузки, при котором определение глюкозы в крови проводят через определенные промежутки времени. Эти данные являются более ценными, чем однократное определение содержания глюкозы в крови. Они позволяют выявить скрытые формы диабета и нарушение гликогенобразовательной функции печени.

Показания для проведения теста на толерантность к глюкозе:

▪ Неоднозначные результаты однократных анализов крови натощак.

▪ Глюкозурия: панкреатическая и внепанкреатическая (первая связана с недостатком секреции или недостаточностью самого инсулина; внепанкреатическая глюкозурия развивается при поражении других органов внутренней секреции, ЦНС, при эмоциональном стрессе, заболеваниях почек, печени, избытке углеводов в диете, при беременности).

▪ Клинические признаки сахарного диабета или его осложнений при нормальной концентрации глюкозы крови натощак (скрытые формы диабета).