Построение калибровочного графика 


Мы поможем в написании ваших работ!



ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Построение калибровочного графика



В пробирки вносят растворы в соответствии с таблицей, затем в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 2,4-ДНФГ, тщательно перемешивают и через 20 минут (18-250С) вносят по 0,5 мл 0,4н NaOH.

 

№ п/п Стандартный р-р пирувата натрия Физиологич. раствор Субстратный раствор АлАТ/АсАТ Активность фермента (АсАТ, АлАТ)
мл мл мл ммоль/(ч*л) мккат/л
  0,05 0,1 0,45 1,0 0,28
  0,1 0,1 0,40 2,0 0,56
  0,15 0,1 0,35 3,0 0,83
  0,2 0,1 0,30 4,0 1,11
  0,25 0,1 0,25 5,0 1,39
контроль 0,1 0,50    

 

Инкубирую при комнатной температуре 10 минут и затем фотометрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против контроля. На оси координат откладывают найденную величину оптической плотности, на оси абсцисс – активность фермента в ммоль/ч*л или в мккат/л («ммоль/ч*л» соответствует 0,278 «мккат/л»).

Калибровочная кривая до величины оптической плотности 0,3. При более высоких значениях оптической плотности сыворотку крови необходимо развести и повторить анализ. При расчете активности учесть степень разведения сыворотки (пропорциональность между степенью разведения и активностью фермента в разведенной сыворотке наблюдается не всегда).

 

Указания к оформлению лабораторной работы

В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (активность фермента, моль/ч*л) и сделайте выводы о возможных причинах отклонения полученных результатов от нормальных величин.

 

Контрольные вопросы

1. Какие реакции катализируют и к какому классу ферментов относятся АлАТ и АсАТ?

2. Почему АлАТ и АсАТ называют индикаторными ферментами?

3. Назовите нормальные величины активности исследованных Вами ферментов?

 

Лабораторная работа №23

Определение мочевины в крови по реакции с диацетилмонооксимом (набором реагентов)

Одним из главных продуктов азотистого обмена в организме является мочевина. Синтезируется она в печени, оттуда поступает в кровь и выделяется с мочой. Мочевина составляет около 50% остаточного азота крови. В норме в сыворотке крови содержание мочевины колеблется от 2,5-8,3 ммоль/л. У детей от 1 года до 14 лет – 1,63-6,64 ммоль/л. С мочой взрослого человека за сутки выводится 20-35г, а в возрасте от 1 года до 14 лет – 4,0-16,0г мочевины.

В клинической лабораторной практике определение мочевины необходимо для оценки белкового обмена; своевременной диагностики и лечения врожденных нарушений орнитинового цикла реакций синтеза мочевины; помощи в оценке работы выделительной функции почек, степени почечной и печеночной недостаточности.

Повышение концентрации мочевины в крови (азотемия) отмечается при заболеваниях почек (нарушение их выделительной функции), при усиленном распаде белков, избыточном белковом питании, в случае обезвоживания организма (относительная азотемия), при отравлении фосфором.

Пониженное содержание мочевины в крови и выделение её с мочой наблюдается при заболеваниях печени (дистрофия печени, цирроз, паренхиматозная желтуха), что связано с нарушением её мочевинообразовательной функции; при нефрите, ацидозе, уремии.

Принцип метода. В кислой среде в присутсвии тисемикарбазида и ионов трехвалентного железа мочевина образует с диацетилмонооксимом комплексное соединение красного цвета, оптическая плотность которого при 510нм пропорциональна концентрации мочевины.

 

Исследуемый материал и реактивы

1. Сыворотка (плазма) крови без гемолиза. 2. Вата. 3. Спирт. 4. Скарификатор. 5. Реакционная смесь сухая (4 пробирки). 6. Раствор соли железа трехвалентного (5 ммоль/л). 7. Калибровочный раствор мочевины (8 ммоль/л). 8. Кислота серная, концентрированная (96%), х.ч. 9. Кислота трихлоруксусная, ч

 

Ход работы

А. Приготовление раствора серной кислоты. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают около 300 мл дистиллированной воды и при постоянном помешивании добавляют 50 мл серной кислоты. После охлаждения доливают водой до метки. Раствор устойчив.

Б. Приготовление раствора реакционной смеси. В мерную колбу вместимостью 100 мл количественно переносят содержимое пробирки сухой реакционной смеси и растворяют его примерно в 60 мл дистиллированной воды при нагревании 40-500С. После охлаждения добавляют 1 мл раствора соли железа трехвалентного и доливают водой до метки. Раствор стабилен при комнатной температуре в течение 2 недель. Наличие небольшого количества нерастворимого осадка не мешает определению.

В. Приготовление рабочего раствора. Приготовляют смешением 1 доли раствора реакционной смеси с 1 долей раствора серной кислоты. Ежедневно готовят свежий рабочий раствор.

Г. Приготовление раствора ТХУ 50 г/л (для депротеинирования). 10г ТХУ растворяют в 200 мл дистиллированной воды. Раствор устойчив.

Д. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови (без депротеинирования). Образцы: сыворотка (плазма) крови. В пробирки внести реактивы по следующей схеме:

 

  Холостая проба, мл Калибровочная проба, мл (DК) Опытная проба, мл (D0)
Сыворотка (плазма) крови 0,01
Калибровочный раствор мочевины 0,01
Рабочий раствор 2,00 2,00 2,00

 

Содержимое пробирок тщательно перемешивают, отверстия закрывают алюминиевой фольгой и пробирки помещают точно на 10 минут в кипящую водяную баню. Затем пробирки быстро охлаждают в потоке холодной воды и измеряют оптическую плотность при 510нм (490-540нм, зеленый светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 1,0 или 0,5см. Параллельно обрабатывают калибровочный раствор. Окраска устойчива в течение 15 минут.

Е. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови (с депротеинированием). Образцы: сыворотка (плазма) крови липимическая или гемолизированная, цельная кровь.

В пробирки внести реактивы по следующей схеме:

 

  Холостая проба, мл Калибровочная проба, мл (DК) Опытная проба, мл (D0)
Раствор ТХУ 0,1 0,5 0,5
Сыворотка (плазма) крови 0,05
Калибровочный раствор мочевины 0,05
Перемешать и центрифугировать 10 минут при 3000 об/мин
Надосадочная жидкость 0,1 0,1
Рабочий раствор 2,0 2,0 2,0

 

Далее проводят определение, как при анализе без депротеинирования.

Содержания мочевины производят по формуле:

,

где: С – содержание мочевины в опытной пробе, ммоль/л; D0 – оптическая плотность опытной пробы; DК – оптическая плотность калибровочной пробы; 8,0 – содержание мочевины в калибровочном раствора, ммоль/л.

Примечания: при содержании мочевины в крови свыше 17 ммоль/л пробу следует развести дистиллированной водой и анализ провести повторно. Результат умножить на разведение.

При использовании кюветы другого объема расход реактивов может быть пропорционально изменен при сохранении соотношения проба/рабочий раствор 1:100.

 

Указания к оформлению лабораторной работы

В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (концентрацию мочевины в сыворотке крови, ммоль/л) и сделайте выводы о состоянии белкового обмена, работе печени и почек исследуемого.

 

Контрольные вопросы

1. Где и как образуются конечные продукты обмена простых белков? Назовите их.

2. В чем биологический смысл синтеза мочевины?

3. Напишите схему синтеза мочевины.

Биохимия гормонов

Гормоны – класс регуляторных химических соединений, синтезируемых железами внутренней секреции и/или специальными клетками. Значение гормональной продукции заключается в том, что секретируемые гормоны осуществляют регуляцию метаболизма отдельных органов и тканей, определяют состояние физиологических процессов и жизнедеятельности организма в целом. Нарушение синтеза, секреции, транспорта и рецепции гормонов клетками лежит в основе многообразных эндокринных расстройств. В связи с этим понимание механизма эндокринных нарушений чрезвычайно важно для диагностики и целенаправленной терапии эндокринных заболеваний. Механизм действия индивидуальных гормонов необходимо знать не только врачу-эндокринологу, но и медику любой специализации. Гормоны нашли широкое применение в медицине.

Диагностика эндокринной патологии на основании изменения биохимических показателей метаболизма. В клинико-биохимических лабораториях используют методы качественного и количественного определения гормонов, гормоноидов и медиаторов в биологическом материале и лекарственных средствах.

 

Лабораторная работа №24



Поделиться:


Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; просмотров: 899; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 54.205.238.173 (0.012 с.)