Морфологія і функція формених елементів крові.

До форменим елементам крові належать еритроцити, лейкоцити, представлені гранулоцитами (нейтрофільними, еозинофільними і базофільними поліморфно-ядерними) і агранулоцитами (лімфоцитами і моноцитами), а також тромбоцити. У крові міститься незначна кількість плазматичних та інших клітин. На мембранах клітин К. відбуваються ферментативні процеси і здійснюються імунні реакції. Мембрани клітин К. несуть інформацію про групи К. в тканинних антигени.

Еритроцити (близько 85%) є без'ядерними двояковогнутого клітинами з рівною поверхнею (діскоцітов), діаметром 7-8 мкм (рис. 1). Обсяг клітини 90 мкм3 площа 142 мкм2, найбільша товщина 2,4 мкм, мінімальна - 1 мкм, середній діаметр на висушених препаратах 7,55 мкм. Суху речовину еритроцита містить близько 95% гемоглобіну, 5% припадає на частку інших речовин (негемоглобінового білки і ліпіди). Ультраструктура еритроцитів одноманітна. При дослідженні їх за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа відзначається висока однорідна електронно-оптична щільність цитоплазми за рахунок міститься в ній гемоглобіну; органели відсутні. На більш ранніх стадіях розвитку еритроцита (ретикулоцитів) в цитоплазмі можна виявити залишки структур клітин-попередників (мітохондрії і ін.). Клітинна мембрана еритроцита на всьому протязі однакова; вона має складну будову. Якщо мембрана еритроцитів порушується, то клітини приймають сферичні форми (стоматоціти, ехіноціти, сфероціти). При дослідженні в скануючому електронному мікроскопі (растрова електронна мікроскопія) визначають різні форми еритроцитів в залежності від їх поверхневої архітектоніки. Трансформація дискоцитов викликається низкою факторів, як внутрішньоклітинних, так і позаклітинних (рис. 2)

Еритроцити в залежності від розміру називають нормо, мікро- і макроцітамі. У здорових дорослих людей кількість нормоцітов становить в середньому 70%.

Визначення розмірів еритроцитів (ерітроцітометрія) дає уявлення про ерітроцітопоез. Для характеристики ерітроцітопоеза використовують також ерітрограмм - результат розподілу еритроцитів по будь-якою ознакою (наприклад, по діаметру, вмісту гемоглобіну), виражений у відсотках і (або) графічно.

Зрілі еритроцити не здатні до синтезу нуклеїнових кислот і гемоглобіну. Для них характерний відносно низький рівень обміну, що обумовлює тривалу тривалість їх життя (приблизно 120 днів). Починаючи з 60-го дня після попадання еритроцита в кров'яне русло поступово знижується активність ферментів. Це призводить до порушення гліколізу і, отже, до зменшення потенціалу енергетичних процесів в еритроциті. Зміни внутрішньоклітинного обміну пов'язані зі старінням клітини і в підсумку призводять до її руйнування. Велике число еритроцитів (близько 200 млрд.) Щодня піддається деструктивним змінам і гине.

Лейкоцити. Гранулоцити - нейтрофільні (нейтрофіли), еозинофільні (еозинофіли), базофільні (базофіли) поліморфноядерні лейкоцити - великі клітини від 9 до 15 мкм, вони циркулюють в К. кілька годин, а потім переміщаються в тканини. У процеси диференціації гранулоцити проходять стадії метамиелоцитов і паличкоядерних форм. У метамієлоцити бобовидное ядро ​​має ніжне будова. У паличкоядерних гранулоцитах хроматин ядра більш щільно упакований, ядро ​​витягується, іноді в ньому намічається освіту часточок (сегментів). У зрілих (сегментоядерних) гранулоцитах ядро ​​зазвичай має кілька сегментів. Всі гранулоцити характеризуються наявністю в цитоплазмі зернистості, яку поділяють на азурофільную і спеціальну. В останній, в свою чергу, розрізняють зрілу і незрілу зернистість.

У нейтрофільних зрілих гранулоцитах кількість сегментів буває від 2 до 5; новоутворення гранул в них не відбувається. Зернистість нейтрофілів забарвлюється барвниками від коричневого до червонувато-фіолетового кольору; цитоплазма - в рожевий колір. Співвідношення азурофільних і спецмулистих гранул не постійно. Відносне число азурофільних гранул досягає 10-20%. Важливу роль в життєдіяльності гранулоцитів грає їх поверхнева мембрана. По набору гидролитических ферментів гранули можуть бути ідентифіковані як лізосоми з деякими специфічними особливостями (наявність фагоцітіна і лізоциму). При ультрацітохіміческіе дослідженні показано, що активність кислої фосфатази в основному пов'язана з азурофільной гранулами, а активність лужної фосфатази - зі спеціальними гранулами. За допомогою цитохімічних реакцій в нейтрофільних гранулоцитах виявлені ліпіди, полісахариди, пероксидаза та ін. Основною функцією нейтрофілів є захисна реакція по відношенню до мікроорганізмів (мікрофаги). Вони активні фагоцити.

Еозинофільні гранулоцити містять ядро, що складається з 2, рідше 3 сегментів. Цитоплазма слабо базофильна. Еозинофільна зернистість забарвлюється кислими аніліновими барвниками, особливо добре еозином (від рожевого до кольору міді). У еозинофілів виявлені пероксидаза, цитохромоксидаза, сукцинатдегідрогеназа, кисла фосфатаза і ін. Еозинофільні гранулоцити мають дезинтоксикационной функцією. Кількість їх збільшується при введенні в організм чужорідного білка. Еозинофілія є характерним симптомом при алергічних станах. Еозинофіли беруть участь в дезінтеграції білка і видаленні білкових продуктів, поряд з іншими гранулоцитами здатні до фагоцитозу.

Базофільні гранулоцити мають властивість забарвлюватися метахроматичні, тобто в відтінки, відмінні від кольору фарби. Ядро цих клітин не має структурних особливостей. У цитоплазмі органели розвинені слабко, в ній визначаються спеціальні гранули полігональної форми (діаметром 0,15-1,2 мкм), що складаються з електронно-щільних частинок. Базофіли поряд з еозинофілами беруть участь в алергічних реакціях організму. Безсумнівна їх роль і в обміні гепарину.

Для всіх гранулоцитів характерна висока лабільність клітинної поверхні, яка проявляється в адгезивних властивості, здатності до агрегації, утворення псевдоподий, пересуванню, фагоцитозу. У гранулоцитах виявлені кейлони - речовини, які надають специфічну дію, пригнічуючи синтез ДНК у клітинах гранулоцитарного ряду.

На відміну від еритроцитів лейкоцити в функціональному відношенні є повноцінними клітинами з великим ядром і мітохондріями, високим вмістом нуклеїнових кислот і окислювальним фосфорилюванням. У них зосереджений весь глікоген крові, службовець джерелом енергії при нестачі кисню, наприклад в осередках запалення. Основна функція сегментоядерних лейкоцитів - фагоцитоз. Їх антимікробну і антивірусна активність пов'язана з виробленням лізоциму та інтерферону.

Лімфоцити - центральна ланка в специфічних імунологічних реакціях; вони є попередниками антителообразующих клітин і носіями імунологічної пам'яті. Основна функція лімфоцитів - вироблення імуноглобулінів (див. Антитіла). Залежно від величини розрізняють малі, середні та великі лімфоцити. У зв'язку з відмінностями імунологічних властивостей виділяють лімфоцити тімусзавісімие (Т-лімфоцити), відповідальні за опосередкований імунну відповідь, і В-лімфоцити, які є попередниками плазматичних клітин і відповідальні за ефективність гуморального імунітету.

Великі лімфоцити (рис. 3) мають зазвичай кругле або овальне ядро, хроматин конденсується по краю ядерної мембрани. У цитоплазмі знаходяться поодинокі рибосоми. Ендоплазматична мережа розвинена слабо. Виявляють 3-5 мітохондрій, рідше їх більше. Пластинчастий комплекс представлений невеликими бульбашками. Визначаються електронно-щільні осміофільние гранули, оточені одношарової мембраною. Малі лімфоцити (рис. 4) характеризуються високим ядерно-цитоплазматичних ставленням. Щільно упакований хроматин утворює великі конгломерати по периферії і в центрі ядра, яке буває овальної або бобовидной форми. Цитоплазматические органели локалізуються на одному полюсі клітини.

Тривалість життя лимфоцита коливається від 15-27 днів до декількох місяців і років.

У хімічному складі лимфоцита найбільш вираженими компонентами є нуклеопротеїни. Лімфоцити містять також катепсини, нуклеазу, амілазу, ліпазу, кислу фосфатазу, сукцинатдегідрогеназу, цитохромоксидазу, аргінін, гістидин, глікоген.

Моноцити - найбільші (12-20 мкм) клітини крові. Форма ядра різноманітна, клітина забарвлюється у фіолетово-червоний колір; хроматиновой мережу в ядрі має широко-нитчасті, пухке будову (рис. 5). Цитоплазма має слабобазофільне властивостями, забарвлюється в синьо-рожевий колір, маючи в різних клітинах різні відтінки. У цитоплазмі визначається дрібна ніжна азурофільной зернистість, дифузно розподілена по всій клітці; забарвлюється в червоний колір. Моноцити мають різко вираженою здатністю до фарбування, амебоідному руху і фагоцитозу, особливо залишків клітин і дрібних чужорідних тіл.

Тромбоцити - поліморфні без'ядерні освіти, оточені мембраною. У кров'яному руслі тромбоцити мають округлу або овальну форму. Залежно від ступеня цілості розрізняють зрілі форми тромбоцитів, юні, старі, так звані форми роздратування і дегенеративні форми (останні зустрічаються у здорових людей вкрай рідко). Нормальні (зрілі) тромбоцити - круглої або овальної форми з діаметром 3-4 мкм; складають 88,2 ± 0,19% всіх тромбоцитів. У них розрізняють зовнішню блідо-блакитну зону (гиаломер) і центральну з азурофільной зернистістю - грануломером (рис. 6). При зіткненні з чужорідної поверхнею волоконця гиаломер, переплітаючись між собою, утворюють на периферії тромбоцита відростки різної величини. Юні (незрілі) тромбоцити - кілька великих розмірів в порівнянні зі зрілими з базофільним вмістом; складають 4,1 ± 0,13%. Старі тромбоцити - різної форми з вузьким обідком і щедрою грануляцією, містять багато вакуолей; складають 4,1 ± 0,21%. Процентне співвідношення різних форм тромбоцитів відображають в тромбоцітограмме (тромбоцитарной формулою), яка залежить від віку, функціонального стану кровотворення, наявності патологічних процесів в організмі. Хімічний склад тромбоцитів досить складний. Так, в їх сухому залишку міститься 0,24% натрію, 0,3% калію, 0,096% кальцію, 0,02% магнію, 0,0012% міді, 0,0065% заліза і 0,00016% марганцю. Наявність в тромбоцитах заліза і міді дозволяє припустити їх участь в диханні. Велика частина кальцію тромбоцитів пов'язана з ліпідами у вигляді ліпідно-кальцієвого комплексу. Важливу роль відіграє калій; в процесі утворення кров'яного згустку він переходить в сироватку крові, що необхідно для здійснення його ретракції. До 60% сухої ваги тромбоцитів складають білки. Зміст ліпідів досягає 16-19% від сухої ваги. У тромбоцитах виявлені також холінплазмалоген і етанолплазмалоген, які відіграють певну роль у ретракції згустку. Крім того, в тромбоцитах відзначаються значні кількості b-глюкуронідази та кислої фосфатази, а також цитохромоксидази і дегідрогенази, полісахариди, гістидин. У тромбоцитах буде встановлено з'єднання, близьке до гликопротеидам, здатне прискорювати процес утворення кров'яного згустку, і невелика кількість РНК і ДНК, які локалізуються в мітохондріях. Хоча в тромбоцитах відсутні ядра, в них протікають всі основні біохімічні процеси, наприклад синтезується білок, відбувається обмін вуглеводів і жирів. Основна функція тромбоцитів - сприяти зупинці кровотечі; вони мають властивість розпластується, агрегувати і стискатися, забезпечуючи тим самим початок утворення кров'яного згустку, а після його формування - ретракція. У тромбоцитах міститься фібриноген, а також скоротливий білок тромбастенін, багато в чому нагадує м'язовий скоротливий білок актомиозин. Вони багаті аденілнуклеотідамі, гликогеном, серотоніном, гістаміном. У гранулах міститься III, а на поверхні адсорбовані V, VII, VIII, IX, X, XI і XIII фактори згортання крові.

1.20 Гемоцітометр

Гемоцитометр - (гемо- + ГИСТ. Cytus клітина + грец. Metreō вимірювати, визначати) - прилад для визначення кількості формених елементів крові, що складається з лічильної камери і двох змішувачів (меланжери), спеціальна скляна камера заздалегідь відомого обсягу, в яку поміщається розчинена кров. Потім візуально, за допомогою мікроскопа підраховується число різних клітин, присутніх в досліджуваному зразку крові. В даний час гемоцітометри в значній мірі замінені електронними лічильниками клітин.

Лічильник формених елементів крові СФЕК-Ц-04.

 

Кількість клітин в суспензії підраховують в спеціальній камері - гемоцітометре. Одночасно визначають життєздатність клітин методом виключення барвника (трипановий синій, еритрозин В, нігрозин). Живі клітини не проникні для барвників, а мертві клітини проникні і фарбуються.

матеріали

- Гемоцітометр

- Клітинна суспензія (повинна бути гомогенна, без агрегати)

- Барвник (готовий до застосування)

- мікроскоп

- дистильована вода

- серветки

 

Протокол вимірювання

1. Підготувати камеру (гемоцітометр) для підрахунку клітин.

Для цього необхідно щільно притерти покривне скло до камери (оптимально - до появи «кілець Ньютона»). Скло і камера повинні бути чистими, сухими без плям. Для цього промивають скло і камеру дистильованою водою і висушують чистими серветками. Для того щоб притертися скло необхідно зволожити або злегка змочити краю скла і / або камери. Притирають двома пальцями по краях скла акуратно натискаючи.

2. Барвник з стоку зазвичай розводять у 10 раз PBS до робочої концентрації (згідно листа опису продукту).

3. Аліквоту суспензії (наприклад 10 або 50 μl) поміщають в лунку 96-ямковий плашки.

4. Змішують з точним обсягом розчину барвника (тобто розводять їм) в лунці. Часто розводять в 10 разів 10 мкл. суспензії і 90 мкл. барвника або в 2 рази - 50 x 50 мкл. до загального обсягу 100 мкл.

5. Кілька мікролітрів суміші вноситься під покривне скло гемоцітометра.

6. Точність підрахунку залежить від щільності клітинної суспензії, її розведення перед внесенням в камеру і від кількості клітин, внесених в камеру. Краще прораховувати не менше 30-40 клітин. Оптимальна кількість (для більшої достовірності результату) 20-50 клітин в квадраті. Оптимальне збільшення мікроскопа 100x (10 ок. X 10 об.).

7. Клітини підраховуються в 5 великих квадратах 1х 1 мм. в напрямку зліва направо зверху вниз (починають з лівого верхнього квадрата, закінчують середнім). Клітини на кордоні квадратів підраховують за правилом - вважати клітини тільки на верхній і лівій межах. Клітини підраховуються в обох камерах (верхньої і нижньої). У кожній камері 9 квадратів, підраховують в 5 з них, у верхній і нижній камерах. Загальна кількість квадратів - 10.

8. Підраховують середня кількість клітин на 1 квадрат за формулою загальна кількість клітин в 10 квадратах / кількість квадратів (10).

9. Кількість клітин далі підраховується за формулами

к-ть клітин в 1 мл. суспензії = середнє число клітин в квадраті (1x1 мм.) x фактор дилюції x 10 000

к-ть клітин в суспензії = к-ть клітин в 1 мл. x загальний обсяг суспензії (в мл.)

Допускається - підраховувати в 4-х квадратах, притирати камеру використовуючи етанол (70%) або видихається пар

Похибка при підрахунку клітин в камері до 20-40%

Посилання з картинками тут

http // www.courses.rochester.edu / olek / B199L / Background / HTML / Hema / Hemacyt.html

http // www.bdbiosciences.com / discovery_labware / technical_resources / labtools / hemaref.html

http // www.bme.gatech.edu / vcl / Tissue_Engineering / Background / 6_cell_passaging.htm

(Тут же можна подивитися відеофільм)

 

Джерело: http://meduniver.com/Medical/Biology/289.html MedUniver

Число бактеріальних або дріжджових клітин в рідкій культурі, наприклад в бульйоні, можна прямо підрахувати за допомогою мікроскопа. Цей метод зручний для підрахунку дріжджових клітин, які набагато більші бактеріальних. При підрахунку бактерій необхідний об'єктив з іммерсійним маслом. Зазвичай для підрахунку використовують особливу предметне скло, зване гемоцітометром, а сам метод відомий як гемоцити-метрія. Щоб забезпечити міцний контакт між предметним склом і покривним склом, слід сильно придавити покривне скло з будь-якого боку камери (але так, щоб не розчавити покривне скло!). Потім покривне скло злегка зрушують до тих пір, поки не здадуться кольорові лінії. Проба рідини, що наноситься піпеткою, затягується під покривне скло за рахунок капілярного ефекту. Камеру залишають на 2-3 хв, щоб клітини осіли - це полегшує підрахунок. Мікроскоп фокусують на решітці і підраховують число клітин на всій решітці, або на її репрезентативному ділянці. Потрібно нарахувати не менше 600 клітин. Якщо клітини лежать на кордоні, їх можна віднести до квадрату, обмеженому двома сторонами (наприклад, верхньої та правої межами), і не вважати їх в квадраті, обмеженому двома іншими сторонами, але не слід намагатися вважати половинки клітин. Кожен маленький квадрат має відому площу, а глибина рідини під покривним склом є постійною (зазвичай 0,02 або 0,1 мм). Отже, можна обчислити об'єм кожного осередку, і підрахувати число клітин в даному обсязі. Якщо число клітин в кожному квадраті перевищує 30, слід розвести пробу. Не забувайте при розрахунках зробити поправку на розведення. На решітці, зображеної на малюнку, кожен маленький квадрат має розміри 0,05 мм х 0,05 мм = 0,0025 мм2 на загальній площі решітки 1 мм2. Якщо зазор між покривним склом і гратами становить 0,02 мм, то загальний обсяг над гратами дорівнює 1 х 0,02 мм = = 0,02 мм 3. Можна, отже, підрахувати число клітин в даному обсязі проби. Запам'ятайте, щоб 1000 мм 3 = 1 см3, а 1000 см3 = 1 дм3 (1л). При підрахунку клітин дріжджів можна використовувати барвник метиленовий синій. При цьому в синій колір забарвлюються тільки мертві клітини. Живі клітини активно виводять барвник з клітки. Таким чином, можна підрахувати число життєздатних клітин, якщо враховувати тільки безбарвні або блідо-блакитні клітини. Вимірювання каламутності Метод, званий нефелометрія, в принципі простий. Чим більше клітин в суспензії, темвише її каламутність, або «затьмарення», ступінь якої можна виміряти. Найпростіше використовувати набір стандартних пробірок (броунівський пробірки), які є у продажу. Вони містять суспензії сульфату барію в різних концентраціях, від прозорої (пробірка 1) до непрозорої (пробірка 10). Зразок суспензії досліджуваних мікроорганізмів поміщають в ідентичну пробірку і підбирають одну зі стандартних пробірок, яка підходить за каламутності суспензії. До набору стандартних пробірок додається таблиця, що дозволяє по каламутності розрахувати концентрації клітин для широкого спектру різних мікроорганізмів. Можна також каламутність вимірювати як частку пропускання світла (або оптичну щільність) суспензією з використанням колориметра або спектрофотометра. Клітинна маса прямо пропорційна оптичної щільності. Найкраще використовувати червоне світло (червоний фільтр), оскільки він не інтерферує з жовтуватим кольором багатьох культуральних середовищ. При вимірі каламутності можливі помилки, якщо зростаючі клітини утворюють грудки (див. Розділ, присвячений підрахунку життєздатних клітин). Найбільш точні результати одержують в тих випадках, коли щільність популяції не надто висока і не дуже низька. Для отримання ідеальної щільності клітин іноді потрібно розведення проб. Некількісні методи Можна використовувати і інші методи вимірювання росту мікроорганізмів. Наприклад, у грибів можна вимірювати зріст як збільшення діаметра міцелію з плином часу. Цей метод був би зручний при вивченні впливу температури на ріст грибів, або при вивченні дії інгібіторів в середовищі. Якщо гриб вирощують в рідкому середовищі, то можна фільтрувати або відцентрифуговувати проби культури через певні інтервали часу і вимірювати масу свіжого або висушеного міцелію.

Джерело: http://meduniver.com/Medical/Biology/289.html MedUniver