Підрахунок еритроцитів і лейкоцитів на приладі СФЕК-Ц-04.

При підрахунку еритроцитів в пробірку набирають 5 мл профільт-рованного фізіологічного розчину і вносять 0,02 мл крові, стабілізованої трилоном Б (розведення 1: 250). У стаканчик відмірюють 10 мл фізіологічного розчину і додають 0,05 мл суміші з пробірки, отримуючи робоче розведення крові 1: 50 000, яке використовують для підрахунку еритроцитів. На столик устанавлівают стаканчик з досліджуваної суспензією і піднімають столік до упору так, щоб, зовнішній електрод і канюля виявилися в стаканчику. Натискають кнопку «Е» на лицьовій панелі і перемещают спусковий важіль вниз до упору. Коли процес підрахунку завершітся, записують свідчення табло. Підрахунок супроводжується звуковими сигналами, частота яких пропорційна концентраціі формених елементів.

При підрахунку лейкоцитів у пробірку, що містить кров в раз-веденні 1: 250 (після того як з пробірки відібрали 0,05 мл для підрахунку еритроцитів), вносять 5 мл фізіологічного розчину. Виходить розведення крові 1: 500. До суміші додають 0,1 МЛ4% -го розчину гіпсофіліна або 2% -го розчину сапоніну, содержімое пробірки перемішують до тих пір, поки воно не стане прозорим (гемоліз еритроцитів). Через 2... 5 хв суспензія готова для підрахунку лейкоцитів. На лицьовій панелі приладу нажімают кнопку «Л», при цьому загоряється світлодіод «Л». Пріготовленную суспензію лейкоцитів поміщають в стаканчик, який встановлюють на столик; останній піднімають до упору вгору. Пусковий важіль переміщують вниз до упору, і коли процес подсчета клітин завершиться, записують свідчення табло.

Визначення кількості формених елементів у птахів (по К. С. Фоміной і В. І. Шмелькова).

Для підрахунку еритроцитів в меланжер до мітки «0,5» набирають кров, а потім до мітки «101» - 0,1% -й розчин Азура II на 0,85% -му розчині хлориду натрію (розведення 1: 200). Перемішують струшуванням протягом 1... 2 хв, випускают на ватку 3... 4 краплі суміші, а наступного краплею заряджають лічильну камеру Горяєва. Спочатку підраховують (об'єктив х40, окуляр х 7) еритроцити в 5 великих квадратах, розташованих по діагоналі і розділених на 16 маленьких квадратиків кожен. Еритроцити овальної форми, містять ядра, не пофарбовані, крупнее інших клітин крові.

Кількість еритроцитів визначають за формулою

Хе = А- \ 010,

де Хе - кількість еритроцитів в 1 л крові; А - число еритроцитів в 5 великих квадратах.

Тромбоцити овальної або веретеноподібної форми, окрашени, добре контуріровани; це найдрібніші клітини крові. Їх підраховують у 100 великих квадратах.

Кількість тромбоцитів визначають за формулою

ХТ = А-5 108,

де ХТ - кількість тромбоцитів в 1 л крові; А - число тромбоцитів в 100 большіх квадратах.

Лейкоцити - це круглі клітини, за розміром менше еритро-цитов, але крупніше тромбоцитів, пофарбовані. Їх підраховують у 100 великих квадратах.

Кількість лейкоцитів визначають за формулою

Хл = Л-5-108,

де Х "- кількість лейкоцитів в 1 л крові; А - число лейкоцитів у 100 великих квадратах.

Зміни кількості формених елементів крові.

Кількість еритроцитів, лейкоцитів і тромбоцитів в крові у здорових жівотних різних видів представлено в таблиці 7.2.

Збільшення кількості еритроцитів - еритроцитоз (поліцитемія, поліглобуліі) - відзначають при втраті організмом жідкості в результаті рясного потіння, проносів, освіти транссудатів і ексудатів (ексудативні плеврити, перитоніти, водянка грудної та черевної порожнин), а також при непроходімості кишечника (механічні іліуси), хронічної альвеолярной емфіземи легенів, отруєннях фосфором, діоксидом углерода, хлором, при декомпенсації серця.

 

 

7.2. Зміст еритроцитів, лейкоцитів і тромбоцитів в крові дорослих здорових тварин різних видів

 

	Эритроциты,	Лейкоциты,	Тромбоциты,
Вид животного	млн/мкл	тыс/мкл	тыс/мкл
	или 107л	или Ю'/л	или Ю'/л
Крупный рогатый скот	5,0...7,5	4,5.-12,0	260.-700
Овцы	7,0...12,0	6,0.-14,0	270.-500
Козы	12,0.-18,0	8,0.-17,0	300...900
Лошади	6,0...9,0	7,0.-12,0	200...500
Свиньи	6,0.-7,5	8,0.-16,0	180.-300
Собаки	5,2.-8,4	8,5.-10,5	250...550
Куры	3,0.-4,0	20,0.-40,0	32...100

Зниження вмісту еритроцитів в крові - Еритропенія (олігоцітемію) - спостерігають при анеміях, зумовлених недостаточним або неповноцінним годівлею (особливо при недостатке білків, заліза, міді, кобальту, марганцю, вітамінів С і групи В), при інфекційних захворюваннях (інфекційна анемія коней і ін.), інтоксикаціях (внаслідок тривалих на-гноітельних і септичних процесів), отруєннях гемолітіческімі отрутами, інвазійних хворобах, гемоспорідіозах (піро-плазмоз, нутталіоз, тейлеріоз, тріпанозамоз і ін.), лейкозах, зло- якісних новоутвореннях, рясних крововтратах.

Підвищення вмісту лейкоцитів в крові - лейкоцитоз - може бути:

фізіологічний - при вагітності (незадовго до пологів і відразу після них), у новонароджених (в перші дні після рожденія), після прийому корму (спостерігають у тварин з однокамерним шлунком; у тварин з багатокамерним шлунком і непреривним процесом травлення травного лейкоцитозу практично немає), після важкої фізичної роботи (міогенний лейкоцитоз);

медикаментозний - після парентерального введення білково-містять і жарознижуючих препаратів, вакцин, сироваток, алкалоїдів, адреналіну, ефірних масел;

патологічний - при гарячково-запальних процесах, багатьох інфекційних захворюваннях, лейкозах.

Зменшення кількості лейкоцитів - лейкопенію - наблюдают при вірусних захворюваннях (чума свиней, інфекційний ен-цефаломіеліт коней, повальне запалення легенів), паратифе телят, стахиботриотоксикозе, виснаженні захисних сил організму, променевої хвороби.

Збільшення кількості кров'яних пластинок в крові - тромбоцитопенія цитоз - зустрічається після операцій, при Миті, ревматизмі, артріте, виразковий коліт, остеомієліті, гострої постгеморагічної і гемолітичної анеміях, запаленні легенів, плевриті, карціноме, лімфогранулематозі, саркоми, миоглобинурии.

Зниження вмісту тромбоцитів в крові - тромбоцитопенія (тромбоцитопенія) - відзначають при більшості гострих інфекціонних захворювань, геморагічних діатезах (кровопятністая болезнь, скорбут), апластична і мегалобластний анеміях, важких хворобах печінки, гіповітаміноз А, інтоксикаціях, стахіботріотоксікозе, лейкозах (в клінічну стадію захворювання), променевої хвороби, запаленні кишечника, пироплазмозе і т. д.

ТЕМА 4. ТЕХНІЧНІ ПРИСТРОЇ ДЛЯ БІОХІМІЧНОГО АНАЛІЗУ.

 

Біохімічні дослідження

За допомогою біохімічних методів визначають активність ферментів і концентрацію субстратів. Аналітичні набори для клінічної хімії засновані на різних аналітичних принципах вимірювання.

Традиційними є методи кінцевої точки, засновані на освіті забарвлених продуктів реакції. Прикладами традиційних методів кінцевої точки є визначення рівня холестерину методом Ілька, глюкози - ортотолуідиновим методом, трансаміназ - методом Райтмана - Френкеля та ін. До недоліків цього методу відносять велику тривалість часу реакції (від 10 до 40 хв), недостатню точність визначення біохімічних параметрів, неможливість проведення заходів з контролю якості досліджень. Контрольні сироватки, які використовують для проведення міжлабораторного і внутрішньолабораторного контролю якості, як правило, не атестовані з поданими методикам.

Кінетичний метод є більш чутливим, ніж метод кінцевої точки, і дозволяє швидше виявити патологічні зміни. При використанні цього методу параметри визначають за 2-5 хв. На анализаторах реєстрація відбувається в автоматичному режимі, активність ферментів оцінюють без калібрування. При використанні цього методу можна легко виявити можливі похибки на аналітичної стадії. У наборах реагентів для кінетичних досліджень, як правило, використовують більш чисті реактиви. Існує багато атестованих по цим методам контрольних сироваток, що дозволяють контролювати якість досліджень з використанням будь-якої системи.

Нефелометрія заснована на феномені розсіювання світла, коли падаючий промінь вдаряється в частку або комплекс антиген - антитіло в розчині. В результаті цього кількість розсіяного світла пропорційно кількості антигену. нефелометрія типово

використовують для визначення рівня специфічних білків, які, зв'язуючись з антитілами, утворюють хрестоподібні частки в розчині. Під нефелометрія зазвичай спеціалізовані окремі аналізатори, що мають обмежене меню тестів, оскільки принцип розсіювання світла можна застосувати тільки для молекул розміром не більше 40 нм. Незважаючи на це, в сучасних автоматичних коагулометри Нефелометричний метод успішно поєднують з іммунотурбідіметріческім і клоттінговимі методами.

Турбидиметричним методика схожа з нефелометрія і заснована на взаємозв'язку проходить променя світла і частки, такий, як імунний комплекс. Кількість світла, що проходить через розчин, зменшується в залежності від каламутності розчину. Основна концепція та сама, що і в абсорбційної спектрофотометрії: кількість проходить через розчин світла зменшується з підвищенням концентрації частинок. Тому за допомогою аналізатора для клінічної хімії можна проводити як традиційні спектрофотометричні, так і іммунотурбідіметріческіе дослідження. Як і при нефелометрії, за допомогою турбідімтріі визначають зміст специфічних білків.

Перевагою іммунотурбідіметріі над нефелометрія є можливість проведення рідкісних тестів на класичних високопродуктивних біохімічних аналізаторах з використанням однієї пробірки.

У рутинної лабораторної практиці для визначення основних параметрів клінічної біохімії найчастіше використовують спектрофотометричні методи визначення. Серед застосовуваних з цією метою аналізаторів можна виділити три групи:

1. Спектрофотометри.

2. Напівавтоматичні біохімічні аналізатори.

3. Повністю автоматизовані аналітичні системи.

Спектрофотометри розраховані на реєстрацію величини

оптичної щільності і виробляють елементарні математичні операції з отриманими величинами. Підготовку реагентів, змішування і внесення зразків, розподіл черговості тестів для всіх цих аналізаторів здійснює лікар-лаборант вручну, тому що використовуються при цьому методики називають ручними, або чуттєвими.

Напівавтоматичні аналізатори також вимагають втручання оператора. Лікар-лаборант готує проби і змішує реагенти. Стадії автоматизовані з моменту введення реакційної суміші в аналізатор.

Застосування ручних і напівавтоматичних методик значно підвищує варіабельність результату аналізу за рахунок вагомого впливу людського фактора, неконтрольованих умов підготовки реакційної суміші, а в ручних методиках - і течії самої реакції.

Повністю автоматизовані біохімічні аналізатори здійснюють дозування реагентів, їх змішування і внесок реакційної суміші в зону аналізатора автоматично. Контроль оператора необхідний тільки на стадії програмування тестів і встановленні регламенту послідовності визначення тих чи інших параметрів і кількості аналізованих проб.

Всі біохімічні автоаналізаторе оснащені сучасним програмним забезпеченням, в них використана сучасна комп'ютерна техніка, здійснюється контроль за роботою окремих блоків приладу і якості проведених лабораторних досліджень (відповідно до закладеної комп'ютерною програмою), автоматизовані пробопідготовка і дозування [2].

Точність біохімічних маркерів багато в чому залежить і від використовуваних реактивів. Найбільш зручними для використання є рідкі, повністю готові до застосування діагностичні набори. Для цих реактивів характерні підвищена стабільність і тривалий термін зберігання. Відсутність стадії розведення (що необхідно для ліофілізованих реактивів) повністю виключає помилки, пов'язані з використанням неякісної води і похибками посуду, а також впливом людського фактора. Завдяки використанню таких реактивів досягаються висока точність і чутливість методів.

Одним з досить інформативних лабораторних тестів, широко використовуваних в даний час, є електрофорез білків біологічних рідин (сироватка крові, сеча, спинномозкова рідина та ін.), Який дозволяє отримати значний обсяг діагностичної інформації. Принцип електрофоретичного розділення молекул полягає в їх русі з різною швидкістю в постійному електричному полі. У клінічній практиці найчастіше використовують електрофорез на підтримуючих середовищах-носіях - хроматографічної папері, ацетатцелюлозних мембранах, різних гелях, а також на комбінованих середовищах.

Електрофорез на папері до недавнього часу широко застосовували в багатьох лабораторіях. Основними недоліками методу є тривалість (2-3 дні) і недостатня точність досліджень.

Електрофорез в агарозному, крохмальної і особливо в полі- акріламідном гелі дає істотно кращі результати, дозволяючи ідентифікувати більшу кількість білкових фракцій сироватки (до 30). Однак складність приготування гелю і дорожнеча готових гелевих пластин обмежують використання даного методу.

Застосування мембран з целюлози ацетату дозволяє підвищити чіткість фракціонування і значно скоротити час, необхідний для поділу, забарвлення і аналізу [1].

Одним з найсучасніших і перспективних сепараційних методів на сьогоднішній день є капілярний електрофорез, що увібрав в себе всі кращі якості хроматографических методів і електрофорезу. [5]. Капілярний електрофорез забезпечує дуже високу ефективність розділення, тому метод широко застосовують не тільки для виявлення схожих за будовою речовин (білків, пептидів, амінокислот, вітамінів, наркотиків, барвників, іонів токсичних металів, аніонів), але і для ідентифікації лікарських препаратів, при проведенні клінічних аналізів, в криміналістиці і судовій експертизі. Метод характеризується не тільки чудовою роздільною здатністю, але і швидкістю виконання [3].

Унікальні системи повністю автоматичного клінічного капілярного електрофорезу дають можливість визначати білкові фракції, специфічні білки, імуноглобуліни, а також проводити скринінг наявності моноклональних компонентів в сироватці крови і сечі без участі лаборанта.

імунохімічні дослідження

Сучасні лабораторні аналізатори є інтегрованими системами, які включають і імунологічні методи дослідження. Імунологічні дослідження набувають все більшу питому вагу в обстеженні пацієнтів. Без результатів імунологічного обстеження неможливо встановити діагнози більшості ендокринних захворювань, вірусних гепатитів, системних колагенозів та ін. Інфекційна імунологія є окремим розділом лабораторної діагностики, що дозволяє ідентифікувати вірусні, бактеріальні, паразитарні інфекції, визначити титри антитіл, оцінити імунітет до окремих видів інфекційних захворювань та ін.

Розвиток практичних імунологічних методів почалося в 60-роках минулого століття з початком впровадження радіоімунних методик (RIA), які характеризуються високою чутливістю і селективністю. В RIA радіоактивний ізотоп використовується в якості мітки, а рівень виміряної радіоактивності є індикатором кількості аналіту. [4]. Це поклало початок проведення інтенсивних досліджень і подальшого широкого застосування радіоіммуноаналіза в лабораторній практиці. RIA використовують і сьогодні, особливо для визначення дуже малих кількостей аналіту. Однак є й його недоліки і перш за все - радіоактивність і проблема поховання відходів. Крім того, в RIA ускладнена стандартизація, так як термін придатності наборів залежить від періоду напіврозпаду радіоактивного йоду-125. Це пояснює розвиток широкого спектра альтернативних методів, які не потребують застосування радіоактивних ізотопів і використовують різні фізичні принципи кількісного визначення мітки.

Зокрема, на зміну RIA прийшов інший тип імунологічних досліджень, який називається імуноферментним аналізом (EIA). В EIA замість радіоактивної використовують ферментні мітки. Типовими ферментними мітками є лужна фосфатаза, пероксидаза хрону і ß-галактозидаза. У той час як в RIA радіоактивність використовується для визначення концентрації аналіту, в EIA застосовуються зміна кольору, емісія світла або інший сигнал.

Твердофазного імуноферментного аналізу представляє популярну форму імуноаналізу, що об'єднує реагент, антитіла (антиген) з ферментативної міткою і твердофазносвязаннимі антитілами (антигеном). Спочатку в якості твердофазного матеріалу використовували або мікротітровочние планшети, або мікрочастинки. Мікротітровочние планшети - це квадратний пластиковий планшеті неглибокими лунками, які покриті реагентом.

Починаючи з кінця 70-х і в 80-90-х роках минулого століття почалося активне впровадження автоматизації і підвищення чутливості імуноферментних методів. Кілька років в цій галузі домінували метод флуоресцентного поляризаційного імуноаналізу і ферментативний аналіз на мікрочастинках. Пізніше почали рутинно застосовувати хемілюмінесцентний магнетичний аналіз завдяки притаманним йому високим аналітичної чутливості.

При проведенні флуоресцентно-полярізаціоннго імуноаналізу (FPIA) антиген мітять флуоресцентною міткою, яка конкурує з немічених антигеном з зразка. Порівняно повільна ротація великих молекул, а також здатність частинок, які повільно рухаються, поляризувати світло застосовуються для визначення кількості великих часток антитіло - антиген - флуоресцеїну в розчині. При цьому принципі вимірювання концентрація аналіту непрямо пропорційна рівню вимірюваного сигналу. Флуоресцентно-поляризаційний іммуноаналіз використовують для проведення точного і чутливого вимірювання для таких малих токсикологічних аналітов, як лікарські препарати, наркотики, токсичні речовини і деякі гормони.

При ферментативному аналізі на мікрочастинках (MEIA) твердофазні мікрочастинки покриті антитілами проти цікавить антигену і використовуються для зв'язування аналіту. Антитіло для детекції мітять ферментом, як і в EIA. Концентрація аналіту пропорційна рівню виміряного сигналу. Неконкурентний принцип сандвіча дає результати, які прямо пропорційні кількості аналіту.

Хемілюмінесцентний магнетичний іммуноаналіз (CMIA): хемілюмінесцентні компоненти теж можна використовувати в якості мітки аналітов. Вони відрізняються від радіоактивної, флуоресцентної і ферментативної мітки. Хемілюмінесцентна мітка продукує світло, коли зв'язується з тригерним реагентом. Цей метод дуже схожий на MEIA, але в CMIA чутливість вище і процедура проміру простіше. Велика кількість аналізаторів в клінічній лабораторній діагностиці засновані на хемілюмінесцентний технології, відрізняється в основному тип мітки, який часто запатентований, тому аналіз також може проводити по-різному. За допомогою різних підвидів імуноаналізу визначають широкий спектр таких аналітов, як гормони, маркери кардіоваскулярної патології, онкологічні маркери.

На сьогодні існують повністю роботизовані інтегровані системи, що дозволяють проводити біохімічні та иммунохимические дослідження на одній універсальній платформі. Одночасно можна досліджувати до 367 зразків. За 1 год визначають до 1200 біохімічних та до 200 імунологічних показників. Запатентовані технології (хемілюмінесцентна акридиновим мітка, система промивання) дозволяють досягти високої точності досліджень.

Таким чином, одними з основних чинників, що визначають якість дослідження, є:

1. Застосовуваний аналітичний метод.

2. Використовувані реактиви.

3. Наявність автоматизованих аналізаторів.

4. Наявність Внутрішньолабораторний і зовнішньої систем контролю якості.

На сьогодні в арсеналі лабораторної діагностики існує досить широкий спектр методик і технологій для заміни старих ручних методів. З огляду на, що результат лабораторного обстеження і своєчасна інформація дуже важливі для лікаря-клініциста, сучасні лабораторії в змозі запропонувати практичному лікарю досить потужні інструменти для щоденної роботи.

Спектрофотометрія

Спектрофотометрія (абсорбційна) - фізико-хімічний метод дослідження розчинів і твердих речовин, заснований на вивченні спектрів поглинання в ультрафіолетовій (200-400 нм), видимої (400-760 нм) та інфрачервоній (> 760 нм) областях спектра. Основна залежність, яка вивчалася в спектрофотометрії, - залежність інтенсивності поглинання (як правило вимірюється оптична щільність - логарифм світлопропускання тому що вона залежить лінійно від концентрації речовини) падаючого світла від довжини хвилі. Спектрофотометрія широко застосовується при вивченні будови і складу різних з'єднань (комплексів, барвників, аналітичних реагентів і ін.), Для якісного і кількісного визначення речовин (визначення слідів елементів в металах, сплавах, технічних об'єктах). Прилади спектрофотометрії - спектрофотометри.

Спектрофотометр (лат. Spectrum - видиме, бачення, грец. Φῶς, родовий відмінок φωτός - світло і μετρέω - вимірюю) - прилад, призначений для вимірювання відносин двох потоків оптичного випромінювання, один з яких - потік, що падає на досліджуваний зразок, інший - потік, що випробував ту чи іншу взаємодію зі зразком. Дозволяє проводити вимірювання для різних довжин хвиль оптичного випромінювання, відповідно в результаті вимірів виходить спектр відносин потоків. Зазвичай використовується для вимірювання спектрів пропускання або спектрів відбиття випромінювання. Спектрофотометр є основним приладом, використовуваним в спектрофотометрії [1].

Застосовується в колориметрії і спектральному аналізі.

Спектрофотометри можуть працювати в різних діапазонах довжин хвиль - від ультрафіолетового до інфрачервоного. Залежно від цього прилади мають різне призначення.