Методика підрахунку еритроцитів, лейкоцитів і тромбоцітов.

Об'єкти дослідження і обладнання.

Кров з антикоагулянтом, вата. Мікроскопи, рахункові камери Горяєва, шліфовані покривні скла, меланжери для еритроцитів і лейкоцитів, лабораторні пробірки з пробками, градуйовані піпетки на 1 і 5 л, піпетки від гемометра Салі.

0,85% -й розчин хлориду натрію, рідина Тюрка, розчин трилону Б (три-лон Б - 50 г, 35... 40% -й розчин формальдегіду - 50 мл, дистильована вода - 450 мл), 2% -й розчин сапоніну, 4% -й розчин гіпсофіліна.

Кількість формених елементів крові визначають з помощью рахункових камер або електронних лічильників частинок. Ерітроціти можна також підрахувати фотоелектроколоріметріческім методом.

Визначення кількості формених елементів в лічильної камері.

Використовують різні рахункові камери - Горяєва, Тома-Цейс, Ьюркера, Тюрка, Предтеченского, Цапперт, Фукса-Розенталя, 'Іпьцхольца, Неубауера і ін. У нашій країні частіше користуються лічильної камерою Горяєва (рис. 7.5), яка являє собою товсте предметне скло з чотирма поперечними жолобками, між якими розташовані три смуги. Середня смуга на 0,1 мм нижче бічних і розділена поздовжнім жолобком на дві рівні половини, на кожній з яких викарбувано сітка Горяева. Коли на поперечні смуги кладуть шліфоване покровное скло і притирають його до утворення інтерференційних кольорових кіл («кільця Ньютона»), над середньою смугою остается щелевидное простір (камера) висотою 0,1 мм.

Мал. 7.5. Устаткування для підрахунку формених елементів крові:

А - рахункова камера Горяєва: / - вид зверху; 2 - вид збоку; 3 - сітка Горяєва (а - малий і б-великий квадрати); Б - змішувачі (меланжери): 1 - еритроцитарний; 2-лейкоцитарний

Площа камери 9 мм 2 (3x3 мм); сітка Горяєва складається з 225 великих квадратів, 25 з них розділені на 16 маленьких квадратиків. Площа маленького квадратика становить 1/400 мм2 (1/20 х 1,20 мм), а обсяг камери над ними 1/4000 мкл (1/400 мм2 х 1,10 мм).

Підрахунок еритроцитів. Щоб підрахувати клітини, кров разводят рідиною - розчинником. Використовують еритроцитарний меланжер (змішувач) або частіше пробірку (пробірочний метод по Н. М. Миколаєву, 1954).

У меланжер спочатку набирають кров до мітки «0,5», кінчик капіляра протирають ваткою, а потім до мітки «101» - рідина, яка являє собою 0,85% -й або 3% -й розчин хлориду натрію; 5% -й розчин цитрату натрію або раствор йоду (йод кристалічний 0,3 г, йодід калію 0,4 г, цитрат натрію 2 г, дистильована вода 100 мл). Меланжер закривають з обох сторін великим і вказівним пальцями і струшують 1... 2хв. В даному випадку виходить розведення 1: 200. З меланжера спочатку видаляють на ватку перші 3 краплі розведеної крові, а наступного заряджають камеру - наносять краплю на середню смужку камери у краю притертість покривного скла. Крапля потрапляє під скло в щілевидний простір і заповнює камеру.

В пробірку спочатку вносять 4 мл 0,85% -го або 3% -го розчину хлоріда натрію, а потім додають 0,02 мл крові піпеткою від гемометра Салі і змішують. Пастерівської піпеткой набирають розбавлену кров (розведення 1: 200) і заряджають розрахункову камеру.

Еритроцити підраховують через 2-3 хв після заповнення камери під мікроскопом (об'єктив х8, окуляр х 15) при затемненному полі (прикривають діафрагму або опускають конденсор) в лівому верхньому великому квадраті (розділеному на 16 маленьких квадратиків), а потім ще в 4 великих квадратах, розташованих по діагоналі або по краях сітки в 4 квадратах і одному в центрі (всього в 5 великих квадратах).

Підрахунок клітин у великому квадраті починають з лівого верхнего маленького квадратика і продовжують у другому, третьому і четвертом квадратиках, розташованих праворуч від першого (рис. 7.6). Підрахувавши еритроцити в верхньому ряду, переходять на нижчий ряд, починаючи вважати в першому правом квадратику, і т. Д. Підраховують всі еритроцити, які лежать всередині маленьких квадратиків, а також на верхній і лівій сторонах великого квадрата; клітини, розташовані на нижній і правій сторонах, не враховують.

Кількість еритроцитів визначають за однією з формул

ХЕІ = АБ / ВГ = А • 10 000, Хеі = Ах1010,

Де Хеі - кількість еритроцитів в 1 мкл крові; ХЛ - кількість еритроцитів вi л крові; А - число еритроцитів в 5 великих квадратах; Б - ступінь розведення крові (200); В - число маленьких квадратиків в 5 великих квадратах (16х5 = 80); / '- Обсяг лічильної камери над маленьким квадратиком (1 / 4000мкл).

Підрахунок лейкоцитів.

Кров можна розводити як в лейкоцітарном меланжери, так і в пробірці.

У меланжер набирають кров до мітки «0,5», а потім до мітки «11» - рідина Тюрка (3% -й розчин оцтової кислоти - 100 мл, I% -й розчин генціан фіолетового або метиленового синього - I мл). Струшують 1... 2хв. Оцтова кислота гемолізує ерітроціти, а генціан фіолетовий або метиленовий синій забарвлюють лейкоцити. Отримують при цьому розведення 1: 20. Випускають 3 краплі на ватку (або фільтрувальну папір), а наступного каплей заряджають лічильну камеру.

В пробірку вносять 0,4 мл рідини Тюрка і 0,02 мл крові, ко-торую набирають піпеткою від гемометра Салі (розведення 1: 20); ретельно перемішують. Суміш відбирають пастерівської піпеткой і заряджають лічильну камеру. Через 2... 3 хв, коли лейкоцити осядуть на дно камери, починають підраховувати клітини під мікроскопом (об'єктив х8, окуляр х 15) при затемненому полі в 100 великих квадратах, які не мають додаткових ліній і розташованих по всій площі сітки Горяєва групами по четире квадрата.

Кількість лейкоцитів визначають за формулою

ХЛ = АБ / ВГ = А- 50,

де.Уд - кількість лейкоцитів в 1 мкл крові; А - число лейкоцитів в 100 большіх квадратах; Б - ступінь розведення крові (20); 5-число маленьких квадратіков в 100 великих квадратах (100 х 16 = 1600.); Г- обсяг лічильної камери над маленькім квадратиком (1/4000 мкл).

Для перерахунку на 1 л крові використовують формулу ХП = Ах5 • 107.

Підрахунок тромбоцитів (по Хауке). У шприц на 1 мл набирають 0,5 мл 1% -го розчину трилону Б і 0,5 мл венозної крові, перемешівают (розведення 1: 1) і відразу переносять в селіконірованную пробірку, яку закривають пробкою. (Кров у пробірці може перебувати кілька годин.). Перед підрахунком вміст пробіркі перемішують і набирають в лейкоцитарний меланжер до мітки «1», а до мітки «11» - 1% -й розчин оксалату амонію (разведеніе крові 1: 20). Ретельно перемішують і витримують 20 хв (для гемолізу еритроцитів). Потім меланжер струшують 2... 3 хв, випускають на ватку 3 краплі суміші, а наступного заряжают лічильну камеру, яку ставлять на 10 хв у вологу камеру (чашка Петрі з ваткою, змоченою водою), щоб тромбоціти осіли на дно камери. Тромбоцити підраховують в 5 великих квадратах, розділених на 16 маленьких квадратиків (об'єктив х 40, окуляр х 7; синій світлофільтр).

Кількість тромбоцитів визначають за формулою

ХГ = АБ / ВГ = А- \ 000,

де ХТ - кількість тромбоцитів в 1 мкл крові; А - число тромбоцитів в 5 большіх квадратах; Б - ступінь розведення крові (20); 5-число маленьких квадратіков в 5 великих квадратах (80); Г-обсяг лічильної камери над маленьким квадратіком (1/4000 мкл).

Для перерахунку на 1 л крові використовують формулу Хт = А • 109.