В. Опишите использование каждого метода в медико-биологических исследованиях.

А. 1-В, 2-С, 3-А.

Б.Электрофорез белков - метод разделения белков под действием электрического поля. Он основан на свойстве заряженных частиц (белков) перемещаться под действием электрического поля. Электрофорез применяют как для анализа компонентов смеси белков, так и для получения гомогенного белка.Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков, является электрофорез белков в полиакриламидном геле. Метод электрофореза основан на различии в скорости движения (подвижности) белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора. В последнее время более широкое распространение получили методы зонального электрофореза белков на различных носителях, в частности на твердых поддерживающих средах: гелях крахмала и полиакриламида, целлюлозе. Преимущества их по сравнению с методом свободного электрофореза состоят в том, что исключается размывание границы белок-растворитель в результате диффузии и конвекции, не требуется налаживания сложной аппаратуры для определения положения границы, а для анализа необходимо небольшое количество белка.

Диализ - процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных частиц с помощью полупроницаемых мембран. Метод основан на неспособности крупных молекул (белков) проникать через полупроницаемые мембраны. В то же время низкомолекулярные примеси легко проходят через поры полупроницаемых мембран. Белки, фракционированные методом осаждения (высаливания) для дальнейшего их использования, часто необходимо очищать от низкомолекулярных соединений (солей). С этой целью проводят диализ. Диализ – это метод очистки коллоидных растворов (в частности, белков) от низкомолекулярных примесей (солей), основанный на свойстве мембран (естественных и искусственных, например, из коллоида, целлофана, пергамента и др.) пропускать только вещества с малой молекулярной массой и задерживать высокомолекулярные соединения.

Высаливание – осаждение белков под действием высоких концентраций солей щелочных и щелочно-земельных металлов. При этом молекулы белков лишаются гидратных оболочек, нейтрализуется их заряд, что приводит к агрегации и выпадению белка в осадок. Осаждение белков растворами нейтральных солей высокой концентрации (насыщенные растворы). Сильным высаливающим эффектом обладают сульфаты натрия (Na2SO4) и аммония ((NH4)2SO4).Механизм высаливания связан с тем, что добавляемые катионы и анионы снимают гидратную оболочку и одновременно, возможно, нейтрализуют заряд белка (состояние близкое к изоэлектрической точке). При таком осаждении сохраняются нативные свойства белков (биологическая активность) и сохраняются все уровни структурной организации белковой молекулы. Если затем к осадку белка добавить воду, удалить диализом соль, то белок снова перейдет в раствор и будет проявлять биологическую активность. Высаливание используют для разделения белков сыворотки крови, молока, яичного белка на две фракции: альбумины и глобулины.

В. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ — направленное перемещение электрически заряженных частиц дисперсной фазы в дисперсионной среде (или ионов в электропроводящем растворе) под действием внешнего электрического поля. В медико-биологических исследованиях применяют множество вариантов двух главных модификаций электрофоретического метода — электрофореза в свободной жидкости (свободнопроточный электрофорез) и зонального электрофореза (зонный электрофорез, или электрофорез на инертных носителях). Метод электрофореза широко используется в биологии и медицине для выделения и анализа индивидуальных белков, нуклеиновых кислот и других биополимеров, вирусов, надмолекулярных клеточных структур, а также целых клеток. При помощи данного метода белки сыворотки крови можно разделить на 5 фракций в соответствии с уменьшением их электрофоретической подвижности: альбумины – самая большая и наиболее быстро движущаяся к аноду фракция, далее следует a₁-глобулины, a₂-глобулины_, b-глобулины, g-глобулины – наиболее медленно движущаяся к аноду фракция. Уменьшение или увеличение отдельных белковых фракций связано с различными заболеваниями. В иммунологии одним из наиболее употребляемых методов исследования является иммуноэлектрофорез — электрофоретическое разделение смеси антигенов или антител в геле с последующий их преципитацией. Путем микроэлектрофореза в клетку можно ввести или к ней подвести любые вещества, способные диссоциировать на ионы. Микроионофорез является одним из основных современных методов в нейрофизиологических, нейрофармакологических, нейрохимических исследованиях. Большое диагностическое значение имеют электрофоретическое разделение ферментов  на коферменты и их количественная и качественная оценка. Введение лекарственных веществ в организм путем электрофореза широко применяется в физиотерапии. Метод электрофореза позволил обнаружить нормальный наследственный полиморфизм белков человека. Стали известны десятки вариантов гемоглобинов, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и других белков. Были получены данные о множественных формах ферментов, последовательно экспрессируемых в ходе онтогенеза и генетически независимых. В результате исследования крови, мочи, цереброспинальной жидкости электрофореза были выявлены изменения нормальной экспрессии генов, кодирующих синтез определенных белков при различных патологических состояниях. С помощью электрофоретического анализа ферментов возможна диагностика, в том числе пренатальная, некоторых врожденных заболеваний.

Диализ широко применяется в медико-биологических исследованиях. На его основе создан аппарат «искусственная почка». Диализ белков - это метод разделения частиц разных размеров в жидкой смеси с помощью тонкой мембраны, поры которой являются слишком мелкими для прохождения больших крупиц (белков), но в то же время они пропускают растворенное кристаллическое вещество. Разжиженная смесь отделяется от воды с помощью этого диффузора, мелкие капельки проходят сквозь преграду, а крупные остаются. Гемодиализ – внепочечное очищение крови. Аппарат «искусственная почка» фильтрует кровь через особую мембрану, очищает ее от воды и токсичных продуктов жизнедеятельности организма. Он работает вместо почек, когда те не в состоянии выполнять свои функции. Аппарат для гемодиализа отфильтровывает из крови токсины, мочевину, избавляет от лишней жидкости, нормализует электролитный баланс, артериальное давление и восстанавливает кислотно-щелочное равновесие. Гемодиализ необходим людям с острой почечной недостаточностью, отравлением лекарственными средствами, спиртами, ядами. Но больше всего в гемодиализе нуждаются люди с хронической почечной недостаточностью. Аппарат берет на себя функции неработающих почек, что позволяет продлить жизнь таких больных на 15-25 лет.

Перитонеальный диализ предполагает очищение почек путем введения диализирующего раствора в брюшную полость через специально установленный катетер ниже пупочной впадины, который через определенный промежуток времени выводится из организма с вредными соединениями, которые отравляют организм.

Кишечный диализ — процедура, при которой внутренняя поверхность толстого кишечника используется в качестве мембраны естественного диализирующего аппарата, подобной мембране аппарата «искусственная почка» при гемодиализе. При кишечном диализе производятся многократные повторные (серийные) промывания кишечника с помощью сифонной клизмы, или с помощью специального аппарата для гидроколонотерапии. При этом осмотическое давление со стороны плазмы крови приводит к переходу различных хорошо диализирующихся ядов, токсинов и продуктов обмена веществ через мембрану толстого кишечника в диализный раствор, используемый для промывания кишечника или клизмы. Кишечный диализ в значительной степени замещает функцию почек и частично замещает детоксикационную функцию печени и приводит к снижению в крови уровня аммиака, мочевины, креатинина и других токсичных продуктов обмена веществ, повышенных при почечной или печеночной недостаточности, уремии.

Высаливание используют для получения различных белков при их разделении, например для разделения альбуминов и глобулинов, определения их соотношения в сыворотке крови. В норме отношение альбумин/глобулин в сыворотке крови человека колеблется в пределах 1,5-2,3 и меняется при патологии, например, при воспалительных заболеваниях увеличивается содержание глобулинов.Высаливание белков используют в процессе приготовления леч. сывороток, при анализе сыворотки крови и т. д. Применяя соли, обычно сульфат аммония или сульфат натрия, в разных концентрациях, осаждают фракции белков с различными молярными весами, обладающих различными физиологическими свойствами.

 

10