Часть II . Определение активности нитратредуктазы по Мульдеру.

1. Листья или корни нарезать острой бритвой полосками шириной около 2 мм, сделать навески по 0,5 г и поместить в бюксы на 50 мл.

2. В важдый бюкс внести по 5 мл фосфатного буфера (0,06 М, pH 7,2), 1 мл 0,1 М раствора яблочной кислоты, предварительно нейтрализованного содой (до прекращения выделения пузырьков), 1 мл 0,1 М раствора KNО₃ и 2 мл воды.

3. Срезы растительного материала с помощью стеклянной палочки смочить раствором, сняв со стенок бюкса.

4. Поместить бюксы в вакуумный шкаф, выкачать воздух для инфильтрации раствора в срезы (происходит контакт нитрата с HP). Реакция восстановления нитратов до нитритов идет в анаэробных условиях в течение 30 мин.

5. По истечению указанного времени бюксы вынуть из шкафа, а реакцию восстановления нитрата остановить, прилив в бюксы по 1 мл уксусной кислоты.

6. Надосадочную жидкость использовать для определения нитритов. Для этого в каждый бюкс добавить по 2 мл реактива Грисса.

7. Определить оптическую плотность окрашенных растворов на ФЭК, используя синий светофильтр. Так как окраска проявляется медленно и в то же время при стоянии раствора исчезает, то измерения выполнять через равные промежутки времени после прибавления реактива Грисса, обычно через 15 - 20 мин.

8. Концентрацию азота в пробе (N-N02) рассчитать по калибровочному графику. Для получения данных для его построения использовать дважды перекристаллизованный нитрит натрия, высушенный при 85°С до постоянной массы. При приготовлении стандартного стокового раствора навеску N—N02 в 0,4927 г (в 1 мл содержится 0,1 мг N), взвешенную на аналитических весах, перенести в мерную колбу на 1 л, долив водой до метки. Раствор хранить в темной склянке в холодильнике.

Рабочий раствор получают разбавлением стоковогораствора в день определения нитратного азота. Для построения калибровочного графика использовать концентрации N—NО₂ в интервале 0,02 - 0,5 мг/л.

9. Нитритный реактив Грисса состоит из равных объемов растворов сульфаниловой кислоты и α-нафтиламина. Для приготовления сульфаниловой кислоты 0,5 г химически чистого реактива растворить в 100 мл 32%-ного раствора (d=l,04) уксусной кислоты. Вначале уксусную кислоту разбавить дистиллированной водой вдвое, а затем довести до нужной плотности по ареометру. Другой компонент смеси готовят растворением 0,1 г α-нафтил-

 

Таблица 14. Активность нитратредуктазы в органах растений

 

Объект	Условия питания	Показания ФЭК	Масса N-NO2 в пробе	Масса N-NO2 на 1 г сырой массы
Листья (корни)	+NO3 +Mo (контроль)
	+NO3 -Mo
	+NН4 +Mo

 

амина в 20 мл воды при нагревании; раствор фильтруют через стеклянный фильтр № 1 в колбу, содержащую 180 мл уксусной кислоты (d= 1,04).

10. Результаты опыта записать в таблицу 14 по приведенной форме.

11. Сделать выводы на основании полученных результатов.

 

 

Работа 22

Определение объема корневой системы методом Сабинина и Колосова

 

Разработанный Д. А. Сабининым и И. И. Колосовым метод позволяет определять объем корней с ошибкой не более 5 – 7 %, что значительно превышает точность метода установления объема по количеству вытесненной воды из сосуда при погружении в него корней (ошибка 20 - 25%). Объем корней определяют при помощи специального объёмомера (Рис. 7).

Прибор состоит из стеклянного цилиндра 1, нижняя часть которого вытянута в трубку 2, соединенную гибкой трубкой 3 с градуированной пипеткой 4 (вместимость пипетки 1 -.2 мл, цена деления 0,01 - 0,02 мл). Оттянутый конец пипетки необходимо отрезать. Объем стеклянного цилиндра подбирают по размеру корневой системы. Чем меньше диаметр цилиндра, тем чувствительней прибор. Стеклянный цилиндр укрепляют в штативе вертикально, а градуированную пипетку—под небольшим углом к горизонту.

В прибор наливают воду или раствор, в котором росли растения. При погружении корней в сосуд уровень воды в нем поднимается и переходит из положения АА ^¢ в положение ВВ ². По закону сообщающихся сосудов водный мениск в пипетке также поднимается, но поскольку она наклонена к горизонтали, то водный мениск в ней передвинется на большее расстояние, чем вода в цилиндре (А"В").

Как видно из рисунка, изменение уровня воды в цилиндре 1 соответствует катету В"С треугольника А"В"С, а передвижение мениска в капилляре - его гипотенузе А"В". Обозначив стороны треугольника буквами а, b, с,а угол между сторонами а и b греческой буквой a, получим:

откуда

Следовательно, сдвиг мениска в пипетке равен изменению уровня воды в цилиндре, умноженному на 1 / sin a. Отсюда, меняя положение пипетки, можно изменять чувствительность прибора. Она тем больше, чем меньше угол a к горизонтали у пипетки.

 

Цель работы. Определить объем корневой системы растений

Объект исследования. Проростки растений