Определение активности пероксидазы

Пероксидазы (КФ 1.11.1.7) - ферменты, окисляющие субстрат при помощи пероксида водорода. Общий вид реакции

 

Н₂О₂ + АН₂ → А + 2Н₂О,

 

где А и АН₂ — окисленный и восстановленный субстраты, соответственно.

 

Субстратами пероксидаз служат фенолы и ароматические соединения, органические гидроперекиси с небольшими алифатическими заместителями, НАДН (НАДФН), нафтогидрохинон, индолилуксусная кислота и др. Пероксидазы - железосодержащие ферменты, простетической группой которых является гем — феррипротопорфирин IX. Окисление субстратов осуществляется, по одноэлектронному механизму. Первой стадией каталитического процесса является образование комплекса между железом фермента и пероксидом водорода. Следовательно, окисление субстрата осуществляется пероксидом водорода, активированным ферментом:

 

E -H2O + H2O2 → E -H2O2 + H2O

Соединение 1

E -H2O2 + AH2 → Соединение 2 + AH∙

Соединение 2 + AH → E -H2O + A

Соединение 1 — окисленная форма фермента, где железо связано с пероксидом и валентное состояние Fe выше Fe³⁺; соединение 2 — продукт восстановления соединения 1 путем одноэлектронного восстановления за счет субстрата АН₂; АН₂ — субстрат реакции; АН∙ — свободнорадикальная форма окисленного субстрата; А — продукт полного окисления субстрата.

 

В растительных тканях пероксидазы широко распространены: в основном их находят в пероксисомах, обнаружены они также в клеточной стенке. Известно более 20 изоформ пероксидазы с различной каталитической активностью. Множественность форм фермента и каталитических функций позволяет судить о значительной роли пероксидаз в биохимии и физиологии растений, однако до сих пор их физиологическое значение окончательно не выяснено. Показано изменение изоферментного состава пероксидаз и их активности в онтогенезе растений, при патогенезе, в условиях стресса. Активность пероксидаз наряду с каталазой, очевидно, препятствует накоплению пероксида водорода в клетке. Используя для окисления пероксид водорода, пероксидазы могут играть важную роль в нейтрализации продуктов вторичного обмена (фенолов), в регуляции гормонального статуса растений через окисление индолилуксусной кислоты, образование этилена из метионина, участвуют в процессах синтеза лигнина в клеточной стенке.

Однако одноэлектронный механизм переноса, который осуществляется пероксидазой при окислении субстрата, может привести к образованию активированных форм кислорода (О₂ и др.), вызывающих повреждающий эффект в клетке. Тем не менее, образованные в пероксидазных реакциях активные формы кислорода могут быть использованы растением в защите от патогенов.

Определение активности пероксидазы, основано на образовании окрашенных продуктов при окислении бензидина, гваякола, гидрохинона, катехола и других фенолов. Общая схема реакции:

 

Пероксидаза

Фенол + Н2О2                          Хинон + 2Н2О

 

В данной работе используется наиболее чувствительный и быстрый гваяколовый метод. При действии пероксидаз в присутствии пероксида водорода гваякол окисляется до тетрагвая - кохинона, что приводит к развитию красно-коричневой окраски в реакционной среде и позволяет провести фотометрическое измерение скорости ее образования.

 

Цель работы. Определение активности пероксидазы в различных органах растения, изменение активности фермента с возрастом растения.

Объект исследования. Листья и корни проростков гороха разного возраста.

Реактивы и оборудование: 1/15 М фосфатный буфер, pH 6,5 - 6,7; 0,1 %-й раствор Н₂О₂; раствор гваякола (0,183 г в 50 мл воды); фарфоровые ступки с пестиками; мерные колбы объемом 50 мл; стеклянные стаканы объемом 100 мл; средние стеклянные воронки; пипетки объемом 2 и 5 мл; автоматические пипетки; бумажные фильтры; ФЭК; стеклянные кюветы к ФЭКу толщиной 2 см.

 

Порядок работы.

1. Навеску растительного материала (50 - 100 мг) растереть в ступке в 5 мл фосфатного буфера.

2. Растертую массу перенести количественно в мерную пробирку, довести пробу буфером до метки 10 мл, перемешать, поместить в холодильник (4°С) на 10 - 15 мин.

3. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Использовать супернатант для определения активности фермента.

4. Исследовать активность фермента на ФЭКе (λ=440 нм) по времени развития окраски до определенного значения оптической плотности (значение D выбрать в зависимости от скорости развития окраски в пределах от 0,25 до 0,4).

5. Для анализа каждой биологической пробы использовать три одинаковые кюветы ФЭКа: одна - контрольная, две другие - опытные (две аналитические повторности из одной биологической пробы).

6. Во все три кюветы внести: 2 мл вытяжки; 2 мл буферного раствора, 2 мл гваякола.

7. В контрольную кювету прилить 2 мл воды и установить ее в контрольную (дальнюю) кюветную подставку ФЭКа. Ввести кювету в световой луч.

8. Закрыть кюветную камеру, установить нуль на шкале оптической плотности по контрольному образцу.

9. Одну из опытных кювет поставить в держатель и ввести в световой луч.

10. Автоматической пипеткой внести в опытную кювету 2 мл раствора Н₂O₂ и одновременно включить секундомер.

11. Закрыть кюветную камеру и по шкале оптической плотности следить за развитием окраски. 12. По секундомеру отметить время достижения необходимой оптической плотности.

13. Аналогично провести измерение для второй опытной кюветы.

14. Провести расчет активности по формуле

 

А=

где А - активность, выраженная в относительных единицах на 1 г сырой массы за 1 с; D - зарегистрированная в опыте оптическая плотность; t - время, с; d - толщина слоя жидкости (толщина кюветы), см; α, β, γ - факторы разведения: α - отношение количества жидкости, взятой для приготовления вытяжки, мл, к массе навески, г; β - степень дополнительного разведения вытяжки после центрифугирования (если это требовалось); γ - степень постоянного разведения вытяжки в кювете (в данной работе равна 4).

15. Представить результаты в виде таблицы (составить самостоятельно).

16. Сделать выводы о зависимости активности фермента от исследуемых физиологических факторов.

 

 

Раздел 4. Водный обмен

 

Все физиологические процессы в растении нормально протекают лишь, при оптимальном его обеспечении водой. Вода - не только растворитель, но и активный структурный компонент клетки. Она участвует в биологических превращениях, например, облегчает взаимодействие между молекулами, служит субстратом для фотосинтеза, участвует в дыхании и многочисленных гидролитических и синтетических процессах.

Вода обладает очень высокой теплоемкостью, поэтому способствует стабилизации температуры растения. Пронизывая все органы, она создает в растении непрерывную фазу, обеспечивая связь органов друг с другом, а также возможность передвижения по растению питательных веществ. Вода играет существенную роль в сохранении формы травянистых растений, поддерживая их клетки в состоянии тургора.

Водный баланс растения определяется соотношением между поглощением и выделением воды. Для сведения водного баланса без дефицита необходимо, чтобы расходование влаги листьями компенсировалось ее поглощением через корни. Подвядание растений приводит к серьезным нарушениям в ультраструктуре клеток и обмене веществ. Даже кратковременный недостаток влаги не проходит для растения бесследно. После установления оптимальных условий водоснабжения фотосинтез восстанавливается лишь через пять - семь дней, рост - через две - три недели, что приводит к значительной потере урожая. Вода поступает в растение в результате корневого давления и присасывающего действия транспирации.

Деятельность нижнего концевого двигателя, состоящая в активном поглощении воды корневой системой, проявляется в плаче и гуттации растений. Силу, поднимающую воду вверх по сосудам, называют корневым давлением. Величина его обычно составляет 50 - 150 кПа. Корневое давление имеет большое значение в поглощении воды растением при подземном прорастании и в весеннее время до распускания листьев. Существенна роль корневого давления в поддержании непрерывности водных нитей в сосудах ксилемы. Корневое давление ликвидирует в ночные часы возникший за день водный дефицит.

Работа верхнего концевого двигателя обусловлена испарением воды с поверхности листа (транспирацией). Присасывающее действие транспирации передается корням в форме гидродинамического натяжения, связывающего работу обоих двигателей. Работа верхнего концевого двигателя, основанная па использовании в качестве источника энергии солнечной радиации, регулируется автоматически (усиление потери влаги снижает водный потенциал испаряющих клеток, что ведет к усилению поступления в них воды). У хорошо облиственных растений присасывающая сила транспирации во много раз превосходит силу корневого давления.

Основную роль в испарении воды растениями играют устьица. Поэтому интенсивность транспирации в значительной степени зависит от степени их открытости. Кроме того, растение может уменьшать транспирацию, снижая испарение воды с поверхности клеток в межклетники за счет возрастания водоудерживающей способности протоплазмы и клеточных стенок.

 

 

Работа 15