Определение содержания основных пигментов фотосинтетического аппарата в листьях высших растений

 

Количественное определение пигментов основано на их способности поглощать лучи определенной длины волны. Регистрацию оптической плотности раствора пигментов проводят на спектрофотометре. Определение концентрации хлорофиллов а и b в растворе без их разделения затруднено, так как спектры обоих хлорофиллов сильно перекрываются, и невозможно найти две длины волны, в которых поглощение обусловливалось бы полностью одним пигментом. Однако имеющиеся различия в спектрах поглощения хлорофиллов а и b позволяют выбрать точки, где поглощение одного пигмента заметно превышает поглощение другого. Это обстоятельство и используют при проведении количественного определения обоих хлорофиллов без их разделения.

Цель работы. Определить содержание хлорофилла а, хлорофилла b и каротиноидов в исследуемом материале.

Объект исследования. Листья растений разных световых экотипов; листья или хвоя одного и того же растения, растущие при разном световом режиме (листья внутри кроны, на верхушке побегов и т. д.); листья разного возраста.

Материалы и оборудование. 96%-й раствор этилового спирта или 80%-й раствор ацетона; MgCO₃ (СаСО₃); кварцевый песок; фарфоровые ступки с пестиками; скальпель; ножницы; пинцет; стеклянные палочки; колба Бунзена со стеклянным фильтром № 3; мерные колбы объемом 25 мл; мерный цилиндр объемом 25 мл; стеклянные воронки; конические пробирки; пипетки объемом 2 и 5 мл; фольга; весы торсионные, спектрофотометр.

 

Порядок работы.

Часть I. Экстракция пигментов

1. Навеску листьев с удаленными крупными листовыми жилками (100 - 200 мг) измельчить ножницами.

2. Поместить в фарфоровую ступку, добавить MgCO₃ на кончике скальпеля, прилить 4 - 5 мл ацетона и тщательно растереть.

3. Полученный гомогенат слить по палочке на стеклянный фильтр, вставленный в колбу Бунзена. Отфильтровать при помощи насоса.

4. Прилить в ступку еще немного ацетона, растереть, слить на фильтр и отфильтровать.

5. Повторять до полного обесцвечивания фильтрата.

6. Перелить вытяжку в мерную колбу, ополоснуть колбу Бунзена несколькими порциями ацетона и довести ацетоном объем вытяжки в мерной колбе до метки.

Работа количественная, нельзя терять ни одной капли! Полученная ацетоновая вытяжка содержит сумму зеленых и желтых пигментов.

 

Часть II. Определение концентрации пигментов на спектрофотометре

1.Часть полученного экстракта налить в кювету спектрофотометра.

2. Контрольную кювету заполнить чистым растворителем (80%-ым раствором ацетона).

3. Кюветы поместить в кюветную камеру спектрофотометра и определить оптическую плотность D вытяжки при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения хлорофиллов а и b в 80%-м растворе ацетона, 663 и 646 нм.

4. Для определения каротиноидов вытяжку промерить при λ=470 нм.

5. Концентрацию хлорофиллов а, b и каротиноидов рассчитать по формулам:

С _а = 12,21 D ₆₆₃ – 2,81 D ₆₄₆

C _b = 20,13 D ₆₄₆ – 5,03 D ₆₆₃

C _кар =

где С _а, C _b и C _кар - концентрация хлорофиллов а, b и каротиноидов, мг/л.

6. Вычислить содержание пигментов А в растительном материале, мг/г сырой массы:

А = V × C / 1000× Р,

где С — концентрация пигментов, мг/л; V — объем вытяжки, мл (25 мл); Р — навеска растительного материала, г (0,1 - 0,2 г).

7. Сделать выводы.

 

 

Работа 10

Разделение пигментов методом хроматографии и количественное определение основных каротиноидов зеленого листа

 

Цель работы. Отделить каротиноиды от хлорофиллов и определить их содержание в зеленых листьях.

 

Объект исследования. Листья высших растений

 

Материалы и оборудование: те же, что в работе 9.

 

Порядок работы.

 

Часть I. Получение вытяжки пигментов

Провести экстракцию пигментов следуя методике, приведенной в работе 9. Смесь для экстракции пигментов – смесь этилового спирта и ацетона в отношении 1: 3.