Правила обращения с микроскопом

 

1. Не допускать загрязнения микроскопов пылью и реактивами, не прикасаться к линзам пальцами. Чистка микроскопов должна производиться квалифицированным работником с помощью сухих хлопчатобумажных салфеток или с применением спиртоэфирной смеси, нейтрального эфира или уайт-спирта.

2. Не допускать механических воздействий па микроскоп: ударов, вибрации, давления. Не применять силу при затруднениях в работе механической части. Не производить неполную разборку микроскопа (снятие револьвера, тубуса, конденсора, подвижного столика) без специального инструктажа. Переносить микроскоп только двумя руками: одной рукой его держат за подставку снизу, а друой - придерживают за тубусодержатель.

3. Соблюдать правила электротехнической безопасности при работе с электрическими осветителями.

4. После окончания работы выключить электроосветитель, перевести револьвер на малое увеличение, опустить конденсор, опустить тубусодержатель, накрыть микроскоп чехлом.

5. О любых неполадках в работе микроскопа немедленно информировать преподавателяилилаборанта.

6. Для работы с масляной иммерсией, реактивами, бинокулярной насадкой и прочими дополнительными принадлежностями необходимо пройти дополнительный инструктаж у преподавателя или лаборанта.

 

 

ПРАВИЛА РАБОТЫ С МИКРОСКОПОМ

1. Подготовить рабочее место: исследователь не должен испытывать дискомфорта и физического напряжения. Микроскоп должен стоять на столе устойчиво (не допускайте возможности падения микроскопа).

2. Перед началом работы установить 8-кратный объектив (8') на расстоянии 1 см от предметного столика, поднять конденсор и открыть диафрагму конденсора.

3. Вынуть окуляр и, глядя в тубус левым глазом, поворотом зеркала добиться максимальной освещенности поля зрения. При использовании рассеянного освещения пользуются вогнутой стороной зеркала.

4. Закрывая диафрагму конденсора, получить изображение краев диафрагмы в поле зрения микроскопа. Для получения большей резкости изображения предварительно опускают конденсор (следует учесть, что при этом уменьшается освещенность препарата).

5. Установить окуляр па место, поместить препарат на предметный столик и, глядя в окуляр левым глазом, плавно вращать винт грубой фокусировки, поднимая тубусодержатель до получения резкого изображения. Опускать тубус можно только при визуальном контроле величины зазора между объективом и покровным стеклом во избежание повреждения препарата и фронтальной линзы объектива.

6. Перемещая препарат руками или с помощью винтов подвижного предметного столика, найти интересующий участок препарата.

7. Не изменяя положения тубу со держателя, поворотом револьвера установить объектив с 40-кратным (40) увеличением. Плавно вращая микрометренный винт (попеременно в разных направлениях), добиться резкого изображения.

8. Для повышения качества изображения повторить операцию п. 4.

9. При изучении препарата подбирают окуляр с необходимым увеличением: от Т до 15'.

10. При необходимости используют светофильтры, вставляя их в кольцо-держатель конденсора или осветителя.

11. После окончания работы устанавливают объектив 8', снимают препарат, опускают конденсор, опускают тубусодержатель, накрывают микроскоп чехлом и ставят его на место.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Задания

Задание 1. Изучите «Правила обращения с микроскопом» и «Правила работы с микроскопом»

Задание 2. Отработайте навыки обращения с микроскопом, используя учебный препарат.

Задание 3. Изучите «Этапы изготовления гистопрепаратов и техника приготовления парафиновых срезов.

Контрольные вопросы.

1. Что такое световой микроскоп и для чего он предназначен?

2. Из каких систем состоит световой микроскоп?

3. Перечислите, что относится к осветительной системе?

4. Перечислите, что относится к наблюдательной системе?

5. Строение и функции механической системы микроскопа?

6. Сходства и различия световой и электронной микроскопии. Разрешающая способность и увеличение.

7. Сущность фиксации и механизм действия фиксаторов. Назовите наиболее употребительные фиксаторы.

8. Преимущества и недостатки трех способов уплотнения материала: заливка в парафин, заливка в целлоидин, замораживание.

 

 

ОСНОВЫ ОБШЕЙ ЦИТОЛОГИИ – БИОЛОГИИ КЛЕТКИ

 

Цель занятий – изучить на уровне световой и электронной микроскопии строение живой клетки, используя гистологические препараты, таблицы, схемы и рисунки.

Средства наглядности. Таблицы с изображением клеток.

Оборудование и материалы. Препараты по общей биологии клетки.

 

Задания для аудиторной работы

 

1. Законспектируйте теоретическую часть занятия.

2. Изучите значение отдельных структур клетки.

3. Изучите основные морфологические компоненты клетки: «Общая морфология клетки. Печень аксолотля». Препарат - 1.

4.Зарисуйте препарат при большом увеличении. Сначала изобразите контуры клеток, а затем ядра.

 

Задания для внеаудиторной работы

1. Законспектируйте «Правила обращения с микроскопом» и «Правила работы с микроскопом».

2. Законспектируйте «Методы изучения клеток. Световая микроскопия».

 

Клетка – это основная структурно-функциональная единица эукариотических организмов, состоящая из ядра, цитоплазмы, раздражимой цитоплазматической мембраны и представляющая собой целостную. Саморегулирующуюся и самовоспроизводящуюся элементарную систему.

Имеются соматические и половые клетки. Соматические клетки, в отличие от половых, имеют диплоидный набор хромосом, и способны делиться. Клетка имеет три основных части: клеточную оболочку, цитоплазму и ядро.

Основные биологические свойства клеток: метаболизм, рост, движение, реактивность, старение и гибель.

 

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

 

Клеточная оболочка придает определенную форму, защищает от вредных воздействий, участвует в метаболизме (обмене веществ), формирует калиево-натриевый «насос», следовательно, имеет электрический заряд-потенциал покоя и потенциал действия, рецепторная функция – гормональные рецепторы в клетках «органов - мишеней» - это особые белки, улавливающие из крови и фиксирующие гормоны.

Гликокаликс клеточной оболочки – состоит из гликопротеидов. Функция: адгезия, т. е. Слипание клеток, расположение рецепторов, внеклеточное пищеварение.

Гиалоплазма – основание клетки. Это гомогенная, однородная коллоидная масса. Она находится все время в движении. В ней находятся органеллы и включения.

Органеллы – постоянные структуры клетки, выполняющие определенные функции. Их делят на мембранные, немембранные и специфического назначения.

Митохондрии имеют форму нитей, зерен, палочек. Функция: окисление углеводов и жиров с образованием АТФ, перенос воды и ионов, в клетках печени синтез белков и жирных кислот, участие в поддержании температуры тела.

Одномембранные органоиды

Эндоплазматическая сеть видна под электронным микроскопом. Она подразделяется на гранулярную (зернистую), имеющую на своей поверхности рибосомы с РНК, и агранулярную (незернистую). Функция: транспортная, гранулярная сеть участвует в синтезе белков, агранулярная – в синтезе углеводов и стероидных гормонов в половых железах и корковом веществе надпочечников, агранулярная – в обезвреживании ядов, поступающих в организм.

Лизосомы в виде зерен, гранул. Значение: переваривают белки, углеводы и нуклеиновые кислоты, автолиз – самопереваривание клеток после их отмирания.

Автолизосомы образуются при слипании первичных лизосом и отработанных внутриклеточных структур.

Пластинчатый комплекс, или аппарат Гольджи состоит из вакуолей, цистерн и микропузырьков, образующих сеточку. Значение: синтез гликогена, жира, секретов, коллагена, всасывание.

Пероксисомы – тельца овальной формы, участвуют в нейтрализации токсических веществ, в том числе и спирта. Их больше всего в клетках печени и почек.

 

Немембранные органоиды

Рибосомы видны под электронным микроскоп, содержат РНК, белок, ферменты. Функция: синтез белков. При этом роль «каменщика», укладывающего «кирпич», т.е. аминокислоты, выполняет рибосомная РНК, «план строительства» записан в молекуле информационной РНК, а «подносчиком» аминокислот является транспортная РНК.

Центросома, или клеточный центр состоит из двух центриолей, соединенных нитями. Значение: участие в митозе, образование жгутиков (хвост спермия), ресничек. Отсутствуют в яйцеклетке.

Микротрубочки выполняют роль каркаса, обеспечивающего форму клеток, роль цитоскелета, Обеспечивают движение хромосом при митозе, входят в состав центриолей, ресничек и жгутиков.

Микрофибриллы – выполняют роль цитоскелета.

Специальные органеллы

Реснички (270-300 шт.) и жгутики (1-8 шт.) образованы клеточным центром. Реснички присущи мерцательному эпителию органов дыхания и маточных труб (яйцеводов). Значение: передвижение.

Тонофибриллы- нити, состоящие из белка. Имеются в шиповатом слое эпидермиса, образуя пружинистый каркас, противодействия давлению.

Нейрофибриллы – нити, состоящие из белка, содержатся в нейроцитах, т.е. нервных клетках, образуя их скелет.

Миофибриллы и миопротофибриллы – нити, состоящие из белков актина и миозина, выполняют сократительную функцию в мышечных тканях.

Микроворсинки – выросты цитолеммы (около 3 тыс. на одной клетке). Их имеет эпителий тонкого кишечника и почек.

 

Включения

Включения – временные образования - вещества поступающие в клетку для целей питания, или продукты ее жизнедеятельности. Различают: трофические, секреторные, экскреторные и пигментные включения.

Секреты и инкреты (гормоны) содержатся в железистых клетках желез внешней и внутренней секреции.

Пигменты – красящие вещества: меланин, гемоглобин, миоглобин, ферритин, лютеин, каротин, родопсин, йодопсин.

Экскреты продукты жизнедеятельности клеток: мочевина, мочевая кислота, желчные пигменты и пр.

Белок в виде включений содержится в клетках печени и яйцеклетке.

Углеводы – гликоген, или животный крахмал. Богаты им клетки печени, мышечные, нервные.

Жиры откладываются в клетках, образуя депо (околосердечный, околопочечный, подкожный жир и пр., шпик, горб, курдюк).

 

Ядро

Ядро – клетки печени, костного мозга и некоторые нейроны могут иметь два и более ядер. Значение: обмен веществ, дыхание, передача наследственной информации.

 

ПРЕПАРАТ 1. Общая морфология клетки. «Печень аксолотля».

 

Препарат представляет собой гистологический срез печени аксолотля, окрашенный гематоксилином и эозином (Микрофото 1). (рис. 3)

Аксолотль – это личинка тигровой амбиостомы, относящейся к хвостатым земноводным, похожая на саламандру, обитающая в Северной Америке. Аксолотль удачный объект для экспериментальной биологии.

При малом увеличении видно, что основная масса печени образована довольно крупными печеночными клетками (гепатоцитами). Эти клетки прилежат друг к другу и располагаются вокруг кровеносных сосудов, имеющих вид полостей округлой или неправильной формы.

 

Рис. 3 Клетки печени аксолотля (личинки амбистомы). А – при большом увеличении: 1 – клеточные границы; 2 – цитоплазма; 3 – вакуоли; 4 – ядра; 5 – печеночные клетки с двумя и большим количеством ядер; 6 – кровеносные сосуды; 7 – слой плоских эндотелиальных клеток; 8 – клетки с отростками (меланофоры); 9 – ядра пигментных клеток; 10 – эритроциты; Б – микроскопирование с иммерсионным объективом: 1- ядерная мембрана; 2 – кариоплазма; 3 – глыбки хроматина; 4 – ядрышко.

 

При малом увеличении необходимо найти такой участок препарата, где его розовый фон был бы наиболее однородным (лучше в центральном отделе среза), его нужно поставить в центр поля зрения и перевести микроскоп на большое увеличение.

При большом увеличении видна розовая цитоплазма и фиолетовое ядро. Форма печеночных клеток неправильно многоугольная. Отдельные клетки гепатоциты вследствие сдавливания соседними клетками на разрезе кажутся круглыми.

Гепатоциты разделены клеточными границами, соответствующими цитоплазматическим мембранам (их обнаруживают при электронной микроскопии) соседних клеток и узким межклеточным пространством. Цитоплазма гепатоцитов слабо оксифильная, окрашивается эозином в светло-розовый цвет, имеет зернистую или сетчатую структуру. Неоднородность цитоплазмы связана с наличием в ней различных структур, выявляемых только при специальной обработке. Относительно мелкие ядра печеночных клеток имеют шарообразную или элипсоидную форму. Круглыми или овальными они выглядят только на срезе. Их величина зависит от уровня, через который прошел срез. Если срез сделан через экваториальную плоскость ядра, его диаметр больше, чем в том случае, когда срез прошел ближе к одному из плюсов ядра. Наличие безъядерных гепатоцитов также объясняется уровнем, на котором прошел срез через клетку. Встречаются двуядерные клетки и большим количеством ядер. Многоядерные гепатоциты образуются в результате амитотического деления ядер без последующего разделения клеточного тела.

При микроскопировании с иммерсионным объективом видно, что ядро обособлено от цитоплазмы ядерной мембраной. В кариоплазме находятся глыбки хроматина различной величины, представляющие собой спирализованные (конденсированные) участки хромосом. Наличие плотно упакованных молекул ДНК в глыбках хроматина обусловливает их базофилию и окраску гематоксилином в фиолетовый цвет. В ядрах некоторых печеночных клеток можно видеть оксифильное, окрашенное эозином в розовый цвет ядрышко. Надо обратить внимание на соотношение по величине ядра и цитоплазмы.

Печеночные клетки располагаются вокруг кровеносных сосудов, стенки которых выстланы слоем плоских эндотелиальных клеток, имеющих на разрезе вид тонкой линии с утолщениями на месте ядра. В просвете кровеносных сосудов могут находиться свободно лежащие клетки крови. Чаще всего они представлены эритроцитами, желтовато-красными клетками овальной формы, с овальными темно-фиолетовыми ядрами. Иногда в просвете сосудов можно видеть единичные лейкоциты, имеющие округлую форму, светлоокрашенную цитоплазму и ядро лопастной или подковообразной формы. По периферии среза в некоторых случаях видны скопления лейкоцитов, образующие так называемый лимфоидный слой печени, являющийся у земноводных местом размножения лейкоцитов. Поверхности соседних клеток слиплись и образовали одноконтурные линии.

Таким образом, на примере одного органа можно наблюдать клетки, значительно отличающиеся по форме, величине и расположению относительно друг друга. Одни из них печеночные клетки, образуют тканевой пласт, в котором, сдавливая друг друга, они принимают полигональную форму. Другие относятся к свободным клеткам (эритроциты, лейкоциты) и имеют более или менее округлую форму.

Форма, размеры и расположение клеток в значительной степени связаны с их функциональными особенностями.

Обозначения: 1. – границы клеток. 2.- ядро. 3. – ядрышко. 4. – цитоплазма.

 

ПРЕПАРАТ Сперматозоиды петуха.

 

Препарат представляет собой мазок эякулята петуха, окрашенный железным гематоксилином.

 

Рис. 4 Сперматозоиды петуха. Мазок спермы. 1- головка; 2 – связующий отдел хвостика.

 

При малом увеличении необходимо найти такой участок препарата, где его серо-черный фон был бы наиболее однородным с негустым расположением спермиев, его нужно поставить в центр поля зрения. Видны спермии, расположенные группами и одиночно. Затем перевести микроскоп на большое увеличение.

При большом увеличении рассмотреть и зарисовать головку, шейку, тело и хвостик спермия. Головка имеет овальную форму, ее интенсивно окрашенный передний участок напоминает луну в первой ее четверти. Остальной участок головки более светлый – это чехлик – остаток цитоплазмы. За головкой спермия находится шейка, которая переходит в тело, а последнее в хвост.

 

Зарисовать 2-3 спермия и сделать на рисунке следующие обозначения:

Обозначения: 1 – головка. 2- шейка. 3 – тело. 4 – хвост спермия.

Контрольные вопросы:

 

1. Понятие о клетке и ее строении.

2. Одномембранные органоиды и их функции.

3. Немебранные органоиды и их функции.

4. Специальные органеллы, их функции.

5. Включения, их функции.

СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКИ

Содержание. Общий обзор строения эукариотической клетки. Иерархия структурных компонентов и их краткая характеристика. Световая микроскопия – основной метод изучения клетки. Правила обращения с микроскопом и правила работы с микроскопом.

Средства наглядности. Таблицы с изображением клеток.

Оборудование и материалы. Препараты по общей морфологии клетки.

Задания для аудиторной работы

5. Законспектируйте теоретическую часть занятия. Обратите внимание на термины, выделенные курсивом. Ответьте на контрольные вопросы.

2. Законспектируйте «Правила обращения с микроскопом» и «Правила работы с микроскопом ».

Задания для внеаудиторной работы

5. Выучите основные положения клеточной теории. Выучите современное определение клетки.

2. Изучите схему «Структурные компоненты эукариотической клетки».

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Клетку как структурный элемент тканей впервые описал английский естествоиспытатель Роберт Гук (1665). (рис. 5)

Рис. 5 Изображение срезов корковой пробки, опубликованное Р. Гуком в 1665 г.

Несколько позже (1680) голландский микроскопист Антонио – Ван – Левенгук открыл существование одноклеточных организмов и отдельных клеток. В 1838-1839 гг. немецкий физиолог Теодор Шванн и немецкий ботаник Маттиас Шлеиден сформулировали основные положения клеточной теории:

7. Клетка есть единица структуры. Все живое состоит из клеток.

2. Клетка есть единица функции. Функции целостного организма распределены по его клеткам. Совокупная деятельность организма есть сумма жизнедеятельности отдельных клеток.

3. Клетка есть единица развития. «Имеется всеобщий принцип развития для всех организмов, и этот принцип развития есть образование клеток».

В 1858 г. немецкий врач Рудольф Вирхов дополнил клеточную теорию положением:

4. Каждая клетка от клетки.

Первые данные о структуре клетки были получены в XVII-XIX вв. По только с

совершенствованием световой и электронной микроскопии, с развитием биохимических методов во второй половине XX в. сформировались современные представления о клетке.

Клетка – элементарная биологическая система, обладающая всеми свойствами и признаками жизни. Клетка – единица структуры, функции и развития организмов.

Существует два основных морфологических типа клеток, различающиеся по организации генетического аппарата: эукариотический и прокариотический. В свою очередь, по способу питания различают два основных подтипа эукариотических клеток: животную (гетеротрофную) и растительную (автотрофную).

СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ

 

Эукариотическая клетка отличается от остальных типов клеток, в первую очередь, наличием ядра, внутри которого находятся линейные хромосомы, основой которых является комплекс из ДНК и белков-гистонов. Ядро - это место хранения, воспроизведения и начальной реализации наследственной информации.

Типичная эукариотическая клетка состоит из трех основных структурных компонентов: ядра, плазмалеммы и цитоплазмы. (табл. 3). (рис. 6)

Липидныевключения Элементы

цитоплазмы

Рис. 6. Органеллы и включения эукариотической клетки [из Fawceli DW. 1986]

Ядро состоит из ядерной оболочки, хроматина, ядрышка и ядерного матрикса.

Плазмалеммa (плазматическая мембрана) – это биологическая мембрана, покрывающая всю клетку и отграничивающая её живое содержимое от внешней среды- Поверх плазмалеммы часто располагаются разнообразные клеточные оболочки (клеточные стенки). В животных клетках клеточные оболочки, как правило, отсутствуют.

Цитоплазма – это часть живой клетки (протопласта) без плазматической мембраны и ядра. Цитоплазма пространственно разделена на функциональные зоны (компартменты), в которых протекают различные процессы. В состав цитоплазмы входят: цитоплазматический матрикс, цитоскелет, органоиды и включения (иногда включения и содержимое вакуолей к живому веществу цитоплазмы не относят). Все органоиды клетки делятся па немембранные, одномембранные и двумембранные.

К немембранным органоидам эукариотической клетки относятся органоиды, не имеющие собственной замкнутой мембраны, а именно: рибосомы и органоиды, построенные на основе тубулиновых микротрубочек — клеточный центр (центриоли) и органоиды движения (жгутики и реснички). В клетках большинства одноклеточных организмов и подавляющего большинства высших (наземных) растений центриоли отсутствуют.

К одномембранным органоидам, относятся: эндоплазматическая сеть, аппарат Гольджи, лизосомы, пероксисомы, сферосомы, вакуоли и некоторые другие. Все одномембранные органоиды связаны между собой в единую вакуолярную систему клетки. В растительных клетках настоящие лизосомы не обнаружены. В то же время в животных клетках отсутствуют настоящие вакуоли.

К двумеморанным органоидам относятся митохондрии и пластиды. Эти органоиды являются полуавтономными, поскольку обладают собственной ДНК и собственным белоксинтезирующим аппаратом. Митохондрии имеются практически во всех эукариотических клетках. Пластиды имеются только в растительных клетках.

Таблица 3