Опыт 3. Выделение казеина из молока

В молоке общее содержание белков находится, как правило, в пределах 2,9-4,0%. Белки молока делят на две группы: казеиновые и сывороточные. Среди белков молока рассматривают: основных белков: казеины (α_s1-, α_s2-, β-), сывороточные белки (β-лактоглобулин, α-лактоальбумин), альбумин сыворотки крови, иммуноглобулины, β₂-микроглобулин, лактоферрин, церулоплазмин и компонент 3 протеозопептонов.

Основной белок коровьего молока – казеин – является фосфопротеидом. На его долю приходится около 80% белкового азота молока. Казеины – это группа гетерогенных фосфопротеидов, самоассоциирующихся в мицеллы в присутствии кальция, цитратов и фосфатов. Основная часть казеина (около 95%) в молоке содержится в виде казеиновых мицелл. Мицеллы соединены между собой с помощью кальция и мицелярного фосфата.

Казеин можно выделить из молока добавлением уксусной кислоты до изоэлектрической точки (рН 4,6). Белок выделяется в виде мягкого, медленно оседающего осадка.

Приборы и реактивы: химический стакан на 100 мл; мерный цилиндр на 100 мл; стеклянные палочки; пробирки; воронки; бумажные фильтры; пипетки; 10% раствор уксусной кислоты; универсальная индикаторная бумага; 10 % раствор гидроксида натрия; молоко; азотная кислота концентрированная; гидроксид аммония концентрированный; спиртовка.

Методика выполнения работы

В стакан емкостью 100 мл налить 20 мл молока и прилить равный объем дистиллированной воды. К этой смесим осторожно, по стеклянной палочке прилить 10% раствор уксусной кислоты до рН 4,6 (2-3 мл уксусной кислоты), рН раствора определить с помощью универсального индикатора. Для этого стеклянной палочкой наносят каплю на универсальную индикаторную бумагу и по шкале определить рН. При рН 4,6 казеин выпадает в осадок. Ему дают отстояться 10 минут. Слить без взбалтывания надосадочную жидкость. В оставшийся осадок добавить по каплям 10% раствор гидроксида натрия до растворения осадка. Полученный раствор отфильтровать через влажный фильтр. С фильтратом провести цветные реакции (биуретовую и ксантопротеиновую).

Подавляющее большинство белков и пептидов при нагревании с крепкой азотной кислотой дает желтое окрашивание, переходящее в оранжевое при добавлении щелочи или аммиака. Эта реакция характерна для бензольного ядра циклических аминокислот. При действии крепкой азотной кислоты на эти аминокислоты происходит нитрование бензольного кольца с образованием нитросоединений желтого цвета.

В пробирку с фильтратом прилить 5-6 капель концентрированной азотной кислоты. Появляется осадок свернувшегося белка, который при осторожном нагревании окрашивается в желтый цвет. Дать пробирке охладиться и осторожно прибавить концентрированный аммиак.

 

Оформление результатов опыта

Полученные результаты записывают в таблицу 3.

Таблица 3

Образец	Цветная реакция	Окраска	Вывод

 

1.3.4 Опыт 4. Колориметрический метод определения содержания доступного лизина

Метод основан на взаимодействии между отрицательно заряженными группами кислого красителя и положительно заряженными группами аминокислот, содержащими азот основных аминокислот – лизина, гистидина и аргинина с образованием нерастворимого комплекса «белок – краситель».

В одном из двух параллельных определений предварительно проводят блокирование свободных ε-аминогрупп лизина пропионовым ангидридом. После удаления нерастворимого комплекса по оптической плотности раствора, используя градуировочный график, определяют количество непрореагировавшего красителя и расчетным путем устанавливают содержание доступного лизина в продукте.

Приборы реактивы: колбы конические на 250 мл; лабораторный встряхиватель; стеклянные фильтры; пипетки Мора на 1мл; мерные цилиндры на 100 мл; спектрофотометр, работающий в области спектра, включающей длину волны 475 нм; краситель «Оранж Ж»; пропионовый ангидрид; кислота лимонная.

Подготовка к анализу