Опыт 1. Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания

Высаливанием называют процесс осаждения белка из раствора под действием нейтральных солей: NaCl, (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄, MgCl₂ и другие. При высаливании белок выпадает в осадок, не подвергаясь денатурации.

При добавлении к растворам белка солей щелочных и щелочно-земельных металлов их ионы адсорбируются на противоположно заряженных группах частиц белка, делая их электронейтральными и тем самым, понижая устойчивость белков в растворе. Кроме того, соли щелочных и щелочно-земельных металлов растворяясь, связывают большие количества воды, что при достаточно высоких концентрациях ведет к дегидратации частиц белка и лишает их гидратной оболочки. Белок при этом выпадает в осадок.

Для осаждения из раствора различных белков используют растворы соли разной концентрации. Глобулины, например, осаждаются полунасыщенным раствором сернокислого аммония, а альбумины – только насыщенным раствором. Это происходит из-за того, что частицы глобулинов значительно крупнее частиц альбуминов, это используется для разделения альбуминов и глобулинов.

Осаждающиеся при высаливании белки способны вновь растворяться в воде, т.к. макромолекулы белков при высаливании, как правило, сохраняют свои нативные свойства.

Приборы и реактивы: штатив с пробирками, воронки, фильтры бумажные, стеклянные палочки, пипетки, 1% раствор яичного белка, сульфат аммония кристаллический, сульфат аммония насыщенный раствор, 10 % раствор гидроксида натрия, 0,5 % раствор сульфата меди.

 

Методика выполнения работы

В пробирку прилить 2-3 мл раствора яичного белка и равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки тщательно перемешать и оставить на 10 минут. Выпадает хлопьевидный осадок глобулина. Осадку дают отстояться, после чего отфильтровать. К фильтрату добавить кристаллический сульфат аммония на кончике шпателя до насыщения; выпадает хлопьевидный осадок альбуминов. Осадок отцентрифугировать в течение 5 минут при 3000 оборотах в минуту. С фильтратом провести биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белков в фильтрате и полноту осаждения. Осадок альбуминов из центрифужной пробирки перенести в пробирку и растворить в 2-3 мл воды. Раствор альбуминов отфильтровать и провести с ним биуретовую реакцию.

Свое название биуретовая реакция получила от производного мочевины – биурета, который дает эту реакцию. Биурет образуется при нагревании мочевины с отщеплением от нее аммиака:

В присутствии солей меди в щелочной среде белки дают фиолетовое окрашивание. Окраску дает комплексное соединение меди с пептидными группами -CO – NH-.

Цвет комплекса, получаемый при биуретовой реакции с разными пептидами, зависит от длины пептидной цепи.

Пептиды с длиной цепи от четырех аминокислотных остатков и выше образуют красный комплекс, трипептиды – фиолетовый, а дипептиды – синий.

В пробирку с фильтратом налить 1 мл раствора едкого натра и 1-2 капли раствора сернокислой меди. При взбалтывании в случае присутствия белков появляется фиолетовое окрашивание.

 

Оформление результатов опыта

Полученные результаты записывают в таблицу 1.

Таблица 1

№ пробирки	Окраска	Вывод

 

Опыт 2. Выделение глобулинов из гороховой и соевой муки

Приборы и реактивы: штатив с пробирками; стеклянные палочки; бумажные фильтры; 10 % раствор хлорида натрия; 10 % раствор гидроксида натрия; 0,5 % раствор сульфата меди; гороховая мука и соевая мука.

 

Методика выполнения работы

В 2 пробирки поместить по 1 г гороховой и соевой муки, прилить 10 мл 10 % раствора хлорида натрия и тщательно перемешать. Извлечение глобулинов проводится при температуре 35⁰С в течение 30 минут в термостате. Через 30 минут жидкость отфильтровывают и с частью раствора проводят биуретовую реакцию.

 

Оформление результатов опыта

Полученные результаты записывают в таблицу 2.

Таблица 2

Образец	Окраска	Вывод