Характеристики тканевых культур

Для культивирования вирусов используют ряд методов. Это культивирование в организме экспериментальных животных, развивающихся куриных вибрионах и культурах тканей (чаще - эмбриональные ткани или опухолевые клетки). Для выращивания клеток тканевых культур используют многокомпонентные питательные среды (среда 199, среда Игла и др.). Они содержат индикатор измерения Ph среды и антибиотики для подавления возможного бактериального загрязнения.

Культуры тканей могут быть переживающими, в которых жизнеспособность клеток удается сохранить лишь временно, и растущими, в которых клетки не только сохраняют жизнедеятельность, но и активно делятся.

В роллерных культурах клетки ткани фиксированы на плотной основе (стекло) - чаще в один слой (однослойные), а в суспензированных - они взвешены в жидкой среде.

По количеству пассажей, выдерживаемых растущей культурой тканей, среди них различают:

· первичные (первично-трипсинизированные) культуры тканей, которые выдерживают не более 5-10 пассажей;

· полуперевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются не более чем в 100 генерациях;

· перевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются в течение неопределенно длительного срока в многочисленных генерациях.

Чаще всего используются однослойные первично-перевиваемые и перевиваемые тканевые культуры.

 

Цитопатическое действие вирусов

О размножении вирусов в культуре ткани можно судить по цитопатическому действию (ЦПД):

· деструкции клеток,

· изменению их морфологии,

· формированию многоядерных симпластов или синтиция в результате слияния клеток.

· в клетках культуры ткани при размножении вирусов могут образовываться включения - структуры, не свойственные нормальным клеткам.

Включения выявляются в окрашенных по Романовскому-Гимза мазках из зараженных клеток. Они бывают эозинофильные и базофильные.

По локализации в клетке различают:

· цитоплазматические,

· ядерные,

· смешанные включения.

Характерные ядерные включения формируются в клетках, зараженных вирусами герпеса (тельца Каудри), цитомегалии и полиомы, аденовирусами, а цитоплазматические включения - вирусами оспы (тельца Гварниери и Пашена), бешенства (тельца Бабеша-Негри) и другие.

О размножении вирусов в культуре ткани также можно судить по методу "бляшек" (негативных колоний). При культивировании вирусов в клеточном монослое под агаровым покрытием на месте пораженных клеток образуются зоны деструкции моносом. Так называемые "стерильные пятна", или бляшки. Это дает возможность не только определить число вирионов в 1 мл среды (считается, что одна бляшка является потомство одного вириона), но и дифференцировать вирусы между собой по феномену бляшкообразрования.

Следующим методом, позволяющим судить о размножении вирусов (только гемагглютинирующих) в культуре ткани, можно считать реакцию гемадсорбции. При культивировании вирусов, обладающих гемагглютинирующей активностью, может происходить избыточный синтез гемагглютининов. Эти молекулы экспрессируются на поверхности клеток культуры ткани, и клетки культуры ткани приобретают способность адсорбировать на себе эритроциты - феномен гемадсорбции. Молекулы гемагглютинина накапливаются и в среде культивирования, это приводит к тому, что культуральная жидкость (в ней накапливаются новые вирионы) приобретет способность вызывать гемагглютинацию.

Наиболее распространенным методом оценки размножения вирусов в культуре ткани является метод "цветной пробы". При размножении в питательной среде с индикатором незараженных клеток культуры ткани вследствие образования кислых продуктов метаболизма она изменяет свой цвет. При репродукции вируса нормальный метаболизм клеток нарушается, кислые продукты не образуются, среда сохраняет исходный цвет.

 

Вопрос 40. Механизмы противовирусной защиты макроорганизма

Неспецифические механизмы

Существование вирусов в двух (внеклеточной и внутриклеточной) формах предопределяют и особенности иммунитета при вирусных инфекциях. В отношении внеклеточных вирусов действуют те же неспецифические и специфические механизмы антимикробной резистентности, что и в отношении бактерий.

Клеточная ареактивность, один из неспецифических факторов защиты. Она обусловлена отсутствием на клетках рецепторов для вирусов, что делает их невосприимчивыми к вирусной инфекции. К этой же группе защитных факторов можно отнести лихорадочную реакцию, выделительные механизмы (чихание, кашель и другие).

В защите от внеклеточного вируса участвуют:

· система комплемента,

· пропердиновая система,

· NK-клетки (естественные киллеры),

· вирусные ингибиторы.

Фагоцитарный механизм защиты мало эффективен в отношении внеклеточного вируса, но достаточно активен в отношении клеток, уже инфицированных вирусов. Экспрессия на поверхности таких вирусных белков делает их объектом макрофагального фагоцитоза. Поскольку вирусы представляют собой комплекс антигенов. То при их попадании в организм развивается иммунный ответ и формируется специфические механизмы защиты - антитела и эффекторные клетки.

 

Специфические механизмы

Антитела действуют только на внеклеточный вирус, препятствуя его взаимодействию с клетками организма и неэффективны против внутриклеточного вируса. Некоторые вирусы (вирус гриппа, аденовирусы) недоступны для циркулирующих в сыворотке крови антител и способны персистировать в организме человека достаточно долго, иногда пожизненно.

При вирусных инфекциях происходит продукция антител классов Ig G и Ig М, а также секреторных антител класса Ig А. Последние обеспечивают местный иммунитет слизистых оболочек на входных воротах, что при развитии вирусных инфекций желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей может иметь определяющее значение. Антитела класса Ig М появляются на 3-5-й день болезни и через несколько недель исчезают, поэтому их наличие в сыворотке обследуемого отражает острую или свежеперенесенную инфекцию. Иммуноглобулины G появляются позже и сохраняются дольше, чем иммуноглобулины М. Они обнаруживаются только через 1-2 недели после начала заболевания и циркулируют в крови в течении длительного времени, обеспечивая тем самым защиту от повторного заражения.

Еще более важную роль, чем гуморальный иммунитет, при всех вирусных инфекциях играет клеточный иммунитет, что связано с тем, что инфицированные вирусом клетки становятся мишенью для цитолитического действия Т-киллеров.

Кроме всего прочего, особенностью взаимодействия вирусов с иммунной системой является способность некоторых из них (так называемые лимфотропные вирусы) поражать непосредственно сами клетки иммунной системы, что приводит к развитию иммунодефицитных состояний.

Все перечисленные механизмы защиты (исключая фагоцитоз зараженных клеток) активны только в отношении внеклеточного вируса. Попав в клетку, вирионы становятся недоступными ни для антител, ни для комплемента, ни для иных механизмов защиты. Для защиты от внутриклеточного вируса в ходе эволюции клетки приобрели способность вырабатывать особый белок - интерферон.

 

Интерфероны

Интерферон - это естественный белок, обладающий противовирусной активностью в отношении внутриклеточных форм вируса. Он нарушает трансляцию и-РНК на рибосомах клеток, инфицированных вирусом, что ведет к прекращению синтеза вирусного белка. Исходя из этого универсального механизма действия, интерферон подавляет репродукцию любых вирусов, т. е. не обладает специфичностью, специфичность интерферона иная. Она носит видовой характер, т. е. человеческий интерферон ингибирует репродукцию вирусов в клетках человека, мышиный - мыши и т. д.

Интерферон обладает и противоопухолевым действием, что является косвенным свидетельством роли вирусов в возникновении опухолей. Образование интерферона в клетке начинается уже через 2 ч после заражения вирусом, т. е. намного раньше, чем его репродукция, и опережает механизм антителообразования.

Интерферон образуют любые клетки, но наиболее активными его продуцентами являются лейкоциты и лимфоциты. В настоящее время методами генной инженерии созданы бактерии (кишечные палочки), в геном которых введены гены (или их копии), ответственные за синтез интерферона в лейкоцитах. Полученный таким образом генно-инженерный интерферон широко используется для лечения и пассивной профилактики вирусных инфекций и некоторых видов опухолей.

В последние годы разработан широкий круг препаратов - индукторов эндогенного интерферона. Их применение предпочтительнее, нежели введение экзогенного интерферона.

Таким образом, интерферон является одним из важных факторов противовирусного иммунитета, но в отличие от антител или клеток-эффекторов он обеспечивает не белковый, а генетический гомеостаз.