Гибридизация нуклеиновых кислот.

Все клетки одного организма содержат абсолютно одинаковые молекулы ДНК. Поэтому, если из клеток разных тканей выделить ДНК, денатурировать её и разделить цепи, а потом смешать одноцепочечные молекулы, то одноцепочечные молекулы, выделенные из разных клеток могут полностью комплиментарно спариться- образовать совершенный гибрид ДНК-ДНК.

В том случае, если смешиваются ДНК разных организмов, то степень их комплим. спарив. будет зависеть от степени родстатва организмов или видов-образуются несовершенные гибриды ДНК-ДНК.

Если гибридизуются ДНК и разные виды РНК, выделенные из прокариотных клеток, то гибридизация будет полной, так как у прокариот первичный транскрипт просто разделяется на РНК разных видов. Подобная гибридизация для эукариотных клеток приводит к образованию несовершенных гибридов, т.к. считанная с ДНК гетерогенная ядерная РНК подвергается процессингу и сплойсингу(вырезанию участков, не имеющих кодирующего значения).

27. Репликация РНК как один из видов матричных синтезов. Этапы репликации. Особенности процесса в эукариотических клетках.

Репликация (самоудвоение, биосинтез) ДНК
В 1953 г. Уотсон и Крик открыли принцип комплементарности (взаимодополняемости). Так, А=Т, а Г=Ц.

Условия, необходимые для репликации:
1. строительный материал - дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дЦТФ ТТФ);
2. энергия, которая выделяется из вышеперечисленных трифосфатов: дАТФ ®дАМФ + ФФн +Q;
3. ионы Мg2+, играющие стабилизирующую роль;
4 матрица - расплетенная двойная спираль ДНК. Это расплетение называется репликативной вилкой [рис. расплетенной ДНК и образовавщейся репликативной вилки];
5. репликативный комплекс ферментов:
- ДНК-раскручивающие белки;
- ДНК-полимераза;
- ДНК-лигаза.

Основные этапы репликации:
1. образование репликативных вилок при участии ДНК-раскручивающих белков, вызывающих разрыв водородных связей между комплементарными основаниями [рис. репликативной вилки, на одном краю которой сплошная линия, а на другом – фрагментами – это фрагменты Оказаки. Помечены 5’ и 3‘ концы];
2. синтез новых нитей ДНК при участии ДНК-полимеразы, катализирующей образование фосфодиэфирной связи между новыми нуклеотидами. Присоединение нуклеотидов идет в соответствии с принципом комплементарности. Синтез идет 5’-конца к 3’-концу. На одной цепи синтез происходит непрерывно, а на другой - прерывается с образованием коротких фрагментов. В результате на одной цепи образуются короткие фрагменты - фрагменты Оказаки;
3. соединение коротких фрагментов с помощью ДНК-лигазы с образованием дочерних нитей.

В результате репликации на одной материнской нити синтезируются 2 комплементарных дочерних ДНК. Т.е. из одной молекулы ДНК образуются 2 копии ДНК.
Репликация протекает в ядре и частично в митохондриях в синтетическую фазу митотического цикла (S фаза).
Значение репликации состоит в передаче информации от ДНК матери к дочерней ДНК.

Репликация линейных геномов эукариот: особенности

Кольцевые замкнутые геномы характерны для многих бактерий, их плазмид и некоторых вирусов. У большинства других организмов геном представлен линейными молекулами ДНК в составе одной или нескольких хромосом. Существует так называемая проблема отстающей цепи ДНК. Синтез отстающей цепи ДНК происходит в виде коротких фрагментов Оказаки, для инициации синтеза которых требуются РНК- затравки (рис. I.49). После удаления затравки на конце одной из вновь синтезированных молекул ДНК образуется одноцепочечная брешь, которая не может быть заполнена ДНК-полимеразой, поскольку она не функционирует в отсутствие праймера. Вследствие этого в каждом раунде репликации должно было бы происходить укорачивание хромосом с обоих концов, что приводило бы к потере генетической информации, закодированной в концевых фрагментах ДНК.

Кроме того, большие размеры молекул ДНК, заключенных в индивидуальные хромосомы, требуют специальной организации их реплицирующего аппарата.

28.Система репарации и принципы её деятельности. Нерепарируемые мутации и способы их коррекции, существующие в клетке.
Репарация — особая функция клеток, заключающаяся в способности исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК, повреждённой при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физических или химических агентов. Осуществляется специальными ферментными системами клетки.

Источники повреждения ДНК

• УФ излучение
• Радиация
• Химические вещества
• Ошибки репликации ДНК
• Апуринизация — отщепление азотистых оснований от сахарофосфатного остова
• Дезаминирование — отщепление аминогруппы от азотистого основания

Основные типы повреждения ДНК

• Повреждение одиночных нуклеотидов
• Повреждение пары нуклеотидов
• Разрыв цепи ДНК
• Образование поперечных сшивок между основаниями одной цепи или разных цепей ДНК

Устройство системы репарации

Каждая из систем репарации включает следующие компоненты:

• фермент, «узнающий» химически изменённые участки в цепи ДНК и осуществляющий разрыв цепи вблизи от повреждения;
• фермент, удаляющий повреждённый участок;
• фермент (ДНК-полимераза), синтезирующий соответствующий участок цепи ДНК взамен удалённого;
• фермент (ДНК-лигаза), замыкающий последнюю связь в полимерной цепи и тем самым восстанавливающий её непрерывность.

Типы репарации

У бактерий имеются по крайней мере 3 ферментные системы, ведущие репарацию — прямая, эксцизионная и пострепликативная.

Прямая репарация

Прямая репарация наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов. Так действует, например, O6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза, которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина.

Эксцизионная репарация

Эксцизионная репарация (англ. excision — вырезание) включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы.

Пострепликативная репарация

Tип репарации, имеющей место в тех случаях, когда процесс эксцизионной репарации недостаточен для полного исправления повреждения: после репликации с образованием ДНК, содержащей поврежденные участки, образуются одноцепочечные бреши, заполняемые в процессе гомологичной рекомбинации при помощи белка RecA.^[1]

Пострепликативная репарация была открыта в клетках E.Coli, не способных выщеплять тиминовые димеры. Это единственный тип репарации, не имеющий этапа узнавания повреждения.

Интересные факты

• Полагают, что от 80 % до 90 % всех раковых заболеваний связаны с отсутствием репарации ДНКhttp://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%E5%EF%E0%F0%E0%F6%E8%FF_%C4%CD%CA - cite_note-konichev-2

Нерепарируемая мутация

Если мутация происходит лишь в одной из цепей ДНК, то репарация возможна, а если в обоих- система репарации просто не сможет заметить ошибку, и репарации в этом участве не будет.

Я не нашёл методы коррекции нерепарируемых мутаций, но прочел в инете что когда кожа сильно облучается солнцем, и происходит масса таких нерепарируемых мутаций- клетки кожи просто погибают и кожа «слезает».

Бисинтез РНК(транскрипция). Строение РНК-полимеразы. Зависимость локализации считываемого участка и направления считывания от структуры промотора. Этапы транскрипции. Посттранскрипционная модификация РНК. Процессинг и сплайсинг.

Транскрипция (передача информации с ДНК на РНК) или биосинтез РНК
При транскрипции, в отличие от репликации, информации передается с небольшого участка ДНК. Элементарной единицей транскрипции является оперон (транскриптон)- участок ДНК, подвергающийся транскрипции.
В опероне выделяют информативные участки - экзоны и неинформативные участки - интроны. В начале оперона выделяют промотор (P) - это начальный участок оперона, к которому присоединяется РНК-полимераза. Рядом с промотором располагается оператор (О) - регуляторная зона, место присоединения генов-регуляторов. В конце оперона располагается терминатор (Т) - участок, содержащий стоп-сигнал. [рис. нескольких последовательных квадратиков: в начале помечаем Р, затем О, а следом экзоны и интроны (какие-то закрашиваем). В конце - Т]

Необходимые условия для транскрипции:
1. расплетенный участок ДНК – одна нить ДНК;
2. строительный материал, представленный нуклеотидами - рибонуклеозидтрифосфаты (АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ);
3. энергия, которая выделяется из вышеперечисленных трифосфатов: АТФ ®АМФ + ФФн +Q;
4. ферменты - ДНК-зависимая РНК-полимераза.

 

Строение РНК-полимеразы
Биосинтез РНК осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами. В ядрах эукариотов обнаружены 3 специализированные РНК-полимеразы: РНК-полимераза I, синтезирующая пре-рРНК; РНК-полимераза II, ответственная за синтез пре-мРНК; РНК-полимераза III, синтезирующая пре-тРНК. РНК-полимеразы - олигомерные ферменты, состоящие из нескольких субъединиц - 2α, β, β', σ. Субъединица о (сигма) выполняет регуляторную функцию, это один из факторов инициации транскрипции, РНК-полимеразы I, II, III, узнающие разные промоторы, содержат разные по строению субъединицы σ.

Этапы транскрипции:
1. инициация (начало);
2. элонгация (продолжение);
3. терминация (окончание).
После транскрипции идет процессинг (созревание) РНК.

1. Инициация - заключается в присоединении ДНК-зависимой РНК-полимеразы к промотору, что приводит к разрыву водородных связей между комплементарными нуклеотидами и расхождение нитей ДНК.
2. Элонгация - это передвижение РНК-полимеразы вдоль нити ДНК, сопровождающееся образованием фосфодиэфирных связей между рибонуклеотидами. Присоединение рибонуклеотидов происходит в соответствии с принципом комплементарности.
Этот синтез идет от 5’ конца к 3’ концу со скоростью 40- 50 нуклеотидов в секунду. Данная фаза протекает до тех пор, пока ДНК-полимераза не достигнет стоп-сигнала, после чего происходит терминация. В результате процессов транскрипции образуется транскрипт (пре-иРНК). Он почти полностью соответствует транскриптону.

Посттранскрипционная модификация РНК. Процессинг и сплайсинг.
Начинается следующий этап - процессинг - посттранскриптационное созревание РНК. Заключается в:
- удаление излишков - вырезаются неинформативные участки;
- сплайсинг - сшивка, соединение информативных участков. При этом иРНК укорачивается.
Из пре-иРНК образуется иРНК. Далее иРНК соединяется с белком-информером, в результате чего образуется комплекс иРНК+ белок =информосома, который может выходить из ядра и транспортироваться в цитоплазму к рибосоме, где начинается следующий этап передачи информации – трансляция.
Центральный постулат генетики (Уотсон и Крик): ДНК®РНК®белок. В 70-е годы был обнаружен фермент – ревертаза (обратная транскриптаза), который позволяет по иРНК синтезировать участок ДНК (РНК®ДНК). Этот процесс называется обратной транскрипцией.

Сплайсинг- Удаление участков, не содержащих информации, и объединение всего остального.

30.Принципы кодирования информации в прокариотических и эукариотических клетках. Основной постулат молекулярной биологии. Генетический код и его характерные черты. Акцепторная роль тРНК. Синтез аминоацил-тРНК как регуляторный механизм трансляции.

Организация генома прокариот (на примере кишечной палочки)

Основу генетического аппарата кишечной палочки составляет бактериальная хромосома, входящая в состав нуклеоида – ядерноподобной структуры. Нуклеоид по морфологии напоминает соцветие цветной капусты и занимает примерно 30% объема цитоплазмы. Бактериальная хромосома представляет собой кольцевую двуспиральную правозакрученную молекулу ДНК, которая свернута во вторичную спираль. Длина бактериальной хромосомы составляет примерно 4,7 млн. нуклеотидных пар (п.н.), или ~ 1,6 мм. Вторичная структура хромосомы поддерживается с помощью гистоноподобных (основных) белков и РНК. Точка прикрепления бактериальной хромосомы к мезосоме (складке плазмалеммы) является точкой начала репликации ДНК (эта точка носит название OriC). Бактериальная хромосома удваивается перед делением клетки, и сестринские копии распределяются по дочерним клеткам с помощью мезосомы.

 

Репликация ДНК идет в две стороны от точки OriC и завершается в точке TerC. Молекулы ДНК, способные себя воспроизводить путем репликации, называются репликоны.

Одна бактериальная хромосома содержит до 1000 известных генов. Обычно это гены «домашнего хозяйства», то есть необходимые для поддержания жизнедеятельности клетки.

Все множество известных генов делится на 10 групп, контролирующих следующие процессы (в скобках указано количество изученных генов):

1. Транспорт различных соединений и ионов в клетку (92).

2. Реакции, поставляющие энергию, включая катаболизм различных природных соединений (138).

3. Реакции синтеза аминокислот, нуклеотидов, витаминов, компонентов цепей переноса электронов, жирных кислот, фосфолипидов и некоторых других соединений (221).

4. Генерация АТФ при переносе электронов (15).

5. Катаболизм макромолекул (22).

6. Аппарат белкового синтеза (164).

7. Синтез нуклеиновых кислот, включая гены, контролирующие реком­бинацию и репарацию (49).

8. Синтез клеточной оболочки (42).

9. Хемотаксис и подвижность (39).

10. Прочие гены, в том числе с неизвестной функцией (110).

 

В лаг–фазе в клетке имеется одна бактериальная хромосома, но в фазе экспоненциального роста ДНК реплицируется быстрее, чем происходит деление клетки; тогда число бактериальных хромосом на клетку увеличивается до 2...4...8. Такое состояние генетического аппарата называется полигаплоидностью.

При делении клетки сестринские копии бактериальной хромосомы распределяются по дочерним клеткам с помощью мезосомы.

Кроме бактериальной хромосомы в состав генетического аппарата прокариот входит множество мелких репликонов – плазмид – кольцевых молекул ДНК длиной в тысячи п.н. Плазмиды такого размера содержат несколько десятков генов. Обычно это «гены роскоши», обеспечивающие устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, кодирующие специфические токсины, а также гены конъюгации и обмена генетическим материалом с другими особями. Известны также мелкие плазмиды длиной 2...3 тпн, кодирующие не более 2 белков. У многих бактерий открыты мегаплазмиды длиной порядка миллиона пн, то есть немногим меньше бактериальной хромосомы. Плазмиды могут быть прикреплены к мезосомам, могут находиться в автономном состоянии и в интегрированном состоянии. В последнем случае плазмида включается в состав бактериальной хромосомы в определенных точках attB. Таким образом, одна и та же плазмида может включаться в состав хромосомы и может вырезаться из нее.

 

Существуют плазмиды, представленные одной копией – они реплицируются синхронно с ДНК бактериальной хромосомы. Другие плазмиды могут быть представлены многими копиями, и их репликация происходит независимо от репликации бактериальной хромосомы. Репликация свободных плазмид часто протекает по принципу «катящегося кольца» – с одной кольцевой матрицы ДНК считывается «бесконечная» копия.

Репликация плазмид может быть синхронизирована с репликацией бактериальной хромосомы, но может быть и независимой. Соответственно, распределение плазмид по дочерним клеткам может быть точным или статистическим.

Организация Генома Эукариот.
В отличие от прокариот основная часть генома эукариот находится в специальном клеточном компартменте (органелле), получившем название ядра, а значительно меньшая часть - в митохондриях, хлоропластах и других пластидах. Так же, как и у прокариот, информационной макромолекулой генома эукариот является ДНК, которая неравномерно распределена по нескольким хромосомам в виде комплексов с многочисленными белками. ДНК-белковые комплексы эукариот получили название хроматина. На протяжении клеточного цикла хроматин претерпевает высокоупорядоченные структурные преобразования в виде последовательных конденсаций-деконденсаций. В соматических клетках при максимальной конденсации в метафазе митоза эти преобразования сопровождаются формированием метафазных хромосом. Морфология и число метафазных хромосом являются уникальными характеристиками вида.

Совокупность внешних признаков хромосомного набора эукариот получила название кариотипа. Эти признаки используются в систематике.

Содержание ДНК у эукариот в расчете на одну клетку в среднем на два-три порядка выше, чем у прокариот, и у разных видов животных изменяется от 168 пг (амфибии) до 1 пг (некоторые виды рыб). У человека имеется около 6 пг ДНК на диплоидный геном, суммарная длина которой приближается к 6*109 п.о. Повышенное содержание ДНК в геноме эукариот нельзя объяснить одним лишь увеличением потребности этих организмов в дополнительной генетической информации в связи с усложнением организации, поскольку большая часть их геномной ДНК, как правило, представлена некодирующими последовательностями нуклеотидов. Размер генома организмов, находящихся на более низких ступенях эволюционного развития, зачастую превышает размеры геномов более высокоорганизованных животных и растений. Известно, что большая часть ДНК генома эукариот не кодирует РНК и белки, и ее генетические функции не вполне понятны.

Основной постулат молекулярной биологии
В подавляющем большинстве случаев передача наследственной информации от материнской клетки к дочерней осуществляется при помощи ДНК репликация. Для использования генетической информации самой клеткой необходимы РНК, образуемые на матрице ДНК транскрипция. Далее РНК непосредственно участвуют на всех этапах синтеза белковых молекул трансляция, обеспечивающих структуру и деятельность клетки.На вышесказанном основана центральная догма молекулярной биологии,согласно которой перенос генетической информации осуществляется только от нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК). Получателем информации может быть другая нуклеиновая кислота (ДНК или РНК) и белок.

 

Генетический код

Генетическая информация, содержащаяся в ДНК и в иРНК, заключена в последовательности расположения нуклеотидов в молекулах. Каким же образом иРНК кодирует (шифрует) первичную структуру белков, т. е. порядок расположения аминокислот в них? Суть кода заключается в том, что последовательность расположения нуклеотидов в иРНК определяет последовательность расположения аминокислот в белках. Этот код называют генетическим, его расшифровка - одно из великих достижений науки. Носителем генетической информации является ДНК, но так как непосредственное участие в синтезе белка принимает иРНК - копия одной из нитей ДНК, то генетический код записан на «языке» РНК.

 

Код триплетен. В состав РНК входят 4 нуклеотида: А, Г, Ц, У. Если бы мы попытались обозначить одну аминокислоту одним нуклеотидом, то можно было бы зашифровать лишь 4 аминокислоты, тогда как их 20 и все они используются в синтезе белков. Двухбуквенный код позволил бы зашифровать 16 аминокислот (из 4 нуклеотидов можно составить 16 различных комбинаций, в каждой из которых имеется 2 нуклеотида).

 

В природе же существует трехбуквенный, или триплетный, код. Это означает, что каждая из 20 аминокислот зашифрована последовательностью 3 нуклеотидов, т. е. триплетом, который получил название кодон. Из 4 нуклеотидов можно создать 64 различные комбинации, по 3 нуклеотида в каждой (43=64). Этого с избытком хватает для кодирования 20 аминокислот и, казалось бы, 44 триплета являются лишними. Однако это не так. Почти каждая аминокислота шифруется более чем одним кодоном (от 2 до 6). Это видно из таблицы генетического кода.

 

Код однозначен. Каждый триплет шифрует только одну аминокислоту. У всех здоровых людей в гене, несущем информацию об одной из цепей гемоглобина, триплет ГАА или ГАГ, стоящий на шестом месте, кодирует глутаминовую кислоту. У больных серповидноклеточной анемией второй нуклеотид в этом триплете заменен на У. Как видно из таблицы генетического кода, триплеты ГУА или ГУГ, которые в этом случае образуются, кодируют аминокислоту валин. К чему приводит такая замена, вы знаете из § Генетическая информация. Удвоение ДНК.

 

Между генами имеются знаки препинания. Каждый ген кодирует одну полипептидную цепочку. Поскольку в ряде случаев иРНК является копией нескольких генов, они должны быть отделены друг от друга. Поэтому в генетическом коде существуют три специальные триплета (УАА, УАГ, УГА), каждый из которых обозначает прекращение синтеза одной полипептидной цепи. Таким образом эти триплеты выполняют функцию знаков препинания. Они находятся в конце каждого гена.

 

Внутри гена нет знаков препинания. Поскольку генетический код подобен языку, разберем это его свойство на примере такой, составленной из триплетов, фразы:

 

жил был кот тих был сер мил мне тот кот

Смысл написанного понятен, несмотря на отсутствие знаков препинания. Если же мы уберем в первом слове одну букву (один нуклеотид в гене), но читать будем также тройками букв, то получится бессмыслица:

 

илб ылк отт ихб ылс ерм илм нет отк от

Бессмыслица возникает и при выпадении одного или двух нуклеотидов из гена. Белок, который считывается с такого «испорченного» гена, не будет иметь ничего общего с тем белком, который кодировался нормальным геном. Поэтому ген в цепи ДНК имеет строго фиксированное начало считывания.

 

Код универсален. Код един для всех живущих на Земле существ. У бактерий и грибов, злаков и мхов, муравья и лягушки, окуня и пеликана, черепахи, лошади и человека одни и те же триплеты кодируют одни и те же аминокислоты.

 

Акцепторная роль тРНК.
тРНК- транспортная РНК, осуществляет доставку аминокислот к рибосоме
1. Связывается с аминокислотами, образуя комплекс аминоацил-тРНК, при помощи аминоацил-тРНК-синтетазы.
2. За счет связывания с 30S-субъединицей и мРНК - образование активной структуры 30S-аминоацил-тРНК-мРНК (отсоединение белковых факторов). Это приводит к образованию рибосомы (комплекса из 30S-50S субъединиц).
3. За счет считывания антикодона тРНК на мРНК - передвижение аминокислоты на один триплет в рибосоме.

 

Синтез Аминоацил…участие в регуляции.
Аминоацил-тРНК-синтетаза (АРСаза) — ферментсинтетаза, катализирующий образование аминоацил-тРНК в реакции этерификации определенной аминокислоты с соответствующей ей молекулой тРНК. Для каждой аминокислоты существует своя аминоацил-тРНК-синтетаза.

АРСазы обеспечивают соответствие нуклеотиднымтриплетамгенетического кода (антикодонутРНК) встраиваемых в белок аминокислот, и, таким образом, обеспечивают правильность происходящего в дальнейшем считывания генетической информации с мРНК при синтезе белков на рибосомах.

Он важен, поскольку лишь благодаря созданию этого комплекса происходит синтез собственно белка.

 

31.Этапы трансляции. Состав трансляционного аппарата клетки. Строение и механизм функционирования рибосом. Роль ОНК в процессе трансляции. Участие белковых комплексов инициации, элонгации и терпинации в биосинтезе полипептидной цепи.

Трансляция (биосинтез белка)

Трансляция - перевод генетического текста иРНК в последовательность АК в белке.

Необходимый комплекс факторов:

1. строительный материал (20 АК);

2. молекулы тРНК (61 вид тРНК). 61 кодону соответствует 20 АК. 1 тРНК распознает более 1 кодона;

3. ферменты: аминоацил-тРНК-синтетаза - обеспечивают узнавание и связывание АК со своей тРНК (20);

4. молекула мРНК. У эукариот иРНК имеет так называемый 'кэп' (от англ.- кепка, шапка) в области 5^'-конца. Кэп представлен метил-ГТФ, необходимой для узнавания иРНК рибосомой и участвует в трансляции;

5. рибосомы, как место синтеза белка. Каждая рибосома состоит из малой и большой субъединиц. У прокариот они более мелкие - 70S: малая субъединица - 30S, большая - 50S. (S- скорость осаждения). У эукариот- 80S: малая - 40S, большая- 60S. Рибосома содержит рРНК, а также около 80 различных белков, в том числе и ферментов.

6. энергия АТФ и ГТФ;

7. ионы Мg^2+, необходимыедля активации ферментов;

8. белковые факторы трансляции – специфические белки различных этапов трансляции.

 

Этапы трансляции:

1. рекогниция – «распознавание»;

2. инициация – «начало»;

3. эллонгация – «продолжение, удлинение»;

4. терминация - «прекращение»;

5. процессинг – «созревание».

 

1. Рекогниция. Происходит связывание АК со своей тРНК: АК+тРНК®(над стрелкой – аминоацил-тРНК-синтетаза, АТФ) аминоацил-тРНК +АМФ+2Ф_н Количество этих реакций зависит от количества АК.

 

2. Инициация. Состоит из 7 фаз:

а) подготовка рибосомы к трансляции. Рибосома (30S) взаимодействует с фактором инициации 3 (ФИ-3), в результате разделяется на малую и большую субъединицы. Малая субъединица находится в комплексе с ФИ-3;

б) подготовка РНК-матрицы к трансляции. мРНК эукариот в области 5’-конца имеет особую структуру – КЭП, представленную метил-ГТФ. В этой фазе происходит присоединение к КЭПу КЭП-связываемых белков. Они обозначают на мРНК место прикрепления рибосомы;

в) подготовка инициаторной аминоацил-тРНК. Кодон, с которого начинается считывание генетической информации, представлен триплетом АУГ – метионин. В качестве инициаторной будет выступать МЕТ-тРНК: МЕТ-тРНК+ГТФ+ФИ-2® инициаторный метионин-тРНК;

г) образование инициирующего комплекса. При этом инициаторная МЕТ-тРНК взаимодействует с малой субъединицей рибосомы с образованием инициирующего комплекса. Этому процессу способствует белковый ФИ-3, связанный с рибосомой;

д) связывание мРНК с инициирующим комплексом: инициирующий комплекс+ ФИ-1+ 5’-конец мРНК. При этом АТФ®АДФ+Ф_н;

е) поиск и комплементарное взаимодействие со стартовым кодоном. При этом происходит скольжение малой субъединицы рибосомы до момента обнаружения кодона АУГ и комплементарного взаимодействия с ним антикодона МЕТ-тРНК;

ж) формирование 80S-рибосомы. Большая субъединица присоединяется к комплексу, образующемуся на 6 стадии, что сопровождается затратой энергии ГТФ (ГТФ®ГДФ+Ф_н). Для этой реакции используется ГТФ, находящаяся в составе инициирующего комплекса. В образовавщейся рибосоме выделяют 2 участка:

- Р-участок, в котором находится МЕТ-тРНК. Здесь будет происходить образование пептидных связей – сайт Р;

- А-участок (аминоацильный участок) – служит для присоединения аминоацильной-тРНК.

В завершении этой фазы происходит высвобождение белковых факторов ФИ-1, ФИ-2, ФИ-3 и КЭП-связанных белков.

 

3. Элонгация. Состоит из 3-х фаз:

а. присоединение следующей аминоацил-тРНК в соответствии со смыслом следующего кодона матрицы. Процесс требует энергии ГТФ ®ГДФ + Ф_н+Q и белкового фактора - фактор элонгации-1 (ФЭ-1);

б. пептизация. Между АК-остатками образуются пептидные связи (между АК-1 и АК-2). Данную реакцию катализирует пептидил-трансфераза. Этот фермент разрушает связь между первой АК и ее тРНК. Первая тРНК покидает рибосому. В результате в амино-ацильном участке рибосомы находится растущий пептид, а Р-участок освобождается;

в. транслокация или перемещение. Рибосома перемещается на 1 кодон в направлении 3’-конца тРНК. При этом пептдтл-тРНК остается на месте и происходит внутририбосомный переход растущего пептида из А-участка рибосомы в Р-участок. Для данного процесса необходимы энергия ГТФ ®ГДФ + Ф_н+Q и белковый фактор - ФЭ-2. Основным результатом является освобождение А-участка рибосомы, в который может поступить следующая аминоацил-тРНК.

Процесс элонгации протекает циклически с 1 по 3 фазу до момента обнаружения стоп-кодона. При достижении рибосомой нонсенс-кодона элонгация прекращается и наступает терминация.

 

4. Терминация.

Нонсенс-кодон распознается белковыми R-факторами (факторы освобождения) в А-участке рибосом. В результате действия R-факторов обеспечивается диссоциация элементов трансляционного аппарата и в цитоплазму высвобождаются рибосома, иРНК, полипептид. СЭС между пептидом и тРНК гидролизуется с затратой энергии ГТФ ®ГДФ + Ф_н+Q. иРНК в дальнейшем может использоваться повторно для трансляции (до разрушения ее иРНКазами).

Собственно трансляция включает 3 этапа: инициация, элонгация, терминация.

 

5. Процессинг белка.

Это совокупность изменений в структуре белка (полипептида), которые заканчиваются формированием структурно и функционально зрелой белковой молекулы. Процессинг может быть 2-х видов:

- котрансляционный, протекающий во время трансляции;

- посттрансляционный – химическая можификация белка происходит после трансляции.

Включает несколько видов химической модификации:

- ограниченный протеолиз - это отщепление либо пептидного фрагмента, либо N-концевой АК (МЕТ);

- реакция ацетилирования - присоединение ацетильного остатка;

- фосфорилирование - присоединение остатка фосфорной кислоты с образованием сложных белков (фосфопротеины);

- гликозилирование АК с образование гликопротеинов и протеогликанов;

- гидроксилирование АК – присоединение –ОН группы. Наиболее часто данному процессу подвергаются ПРО и ЛИЗ с образованием гидроксипролина (ОПР) и гидроксилизина (ОЛИ). Этот процесс необходим при образовании коллагена;

- окисление АК;

- образование вторичной, третичной и четвертичнойструктур – характерно для олигомерных белков. При образовании данных структур белок сворачивается - процесс фолдинга. Для этого необходимы специализированные белки - шапероны. Они ускоряют сворачивание белков, исправляют некорректные формы вторичной, третичной структур. Может наблюдаться патология фолдинга: существуют т.н. отрицательные шапероны. Их присутствие в клетке приводит к неправильному фолдингу, что выражается в гибели клеток.

Рибосомы, как место синтеза белка. Каждая рибосома состоит из малой и большой субъединиц. У прокариот они более мелкие - 70S: малая субъединица - 30S, большая - 50S. (S- скорость осаждения). У эукариот- 80S: малая - 40S, большая- 60S. Рибосома содержит рРНК, а также около 80 различных белков, в том числе и ферментов.
По рибосомам ничего простого и понятного я вообще не нашёл, так что вот что есть:

Трансляция — синтез белка рибосомой на основе информации, записанной в матричной РНК. мРНК связывается с малой субъединицей рибосомы, когда происходит узнавание 3'-концом 16S рибосомной РНК комплементарной последовательности Шайн-Далгарно, расположенной на 5'-конце мРНК, а также позиционирование стартового кодона мРНК на малой субъединице. У эукариот малая субчастица рибосомы связывается также с помощью кэпа, на конце мРНК. Ассоциация малой и большой субъединиц происходит при связывании формилметионил-тРНК и участии факторов инициации. Таким образом, распознавание антикодона происходит на малой субъединице.

После ассоциации, fMET-тРНК находится в P- сайте каталитического центра рибосомы. Следующая тРНК, несущая на 3'-конце аминокислоту и комплементарная второму кодону на мРНК, помещается с помощью фактора EF-Tu в А- сайт каталитического центра рибосомы. Затем, образуется пептидная связь между формилметионином и аминокислотой, принесенной тРНК, находящейся в А-сайте. Механизм катализа образования пептидной связи в пептидил-трансферазном центре до сих пор полностью не ясен. На данный момент существует несколько гипотез, объясняющих детали этого процесса: 1. Оптимальное позиционирование субстратов, 2. Исключение из активного центра воды, способной прервать образование пептидной цепи посредством гидролиза, 3. Участие нуклеотидов рРНК в переносе протона, 4. Участие 2'-гидроксильной группы 3'-концевого нуклеотида тРНК в переносе протона;. Высокая эффективность катализа достигается взаимодействием этих факторов.

После образования пептидной связи, полипептид оказывается связанным с тРНК, находящейся в А-сайте. На следующем этапе деацилированная тРНК двигается из Р-сайта в Е-сайт, а пептидил-тРНК из А- в Р-сайт. Этот процесс называется транслокацией и происходит при участии фактора EF-G. тРНК, комплементарная следующему кодону мРНК, связывается с А-центром рибосомы, что ведет к повторению описанных шагов. Стоп-кодоны сигнализируют об окончании трансляции. Процесс окончания трансляции и освобожения готового полипетида, рибосомы и мРНК, называется терминацией. У прокариот он происходит при участии факторов терминации RF1, RF2, RF3 и RRF.

32.Регуляция биосинтеза белка на уровне репликации и транскрипции. Регуляция биосинтеза белка на этапе трансляции и посттрансляционной модификации.

Регуляция биосинтеза белка

Клетки многоклеточного организма содержат одинаковый набор ДНК, но белки синтезируются разные. Например, соединительная ткань активно синтезирует коллаген, а в мышечных клетках такого белка нет. В эритроцитах содержится Нb, и информация о Нb содержится во всех клетках. С возрастом скорость синтеза изменяется.

 

Основные уровни регуляции биосинтеза:

1. Регуляция синтеза белка на стадии репликации

Регуляция на данной стадии возможна путем добавления (или удаления) кодирующих (или регуляторных) участков на ДНК. Суть данного способа заключается в следующем: если удалить матрицу (“деминуция”), то и синтеза белка с нее не будет, а если увеличить дозу определенного гена в ДНК (“амплификация”, “мультипликация”), то появится возможность ускорить построение белков на многих одинаковых матрицах.

В большинстве случаев наличие избыточной генетической информации отрицательно сказывается на жизнеспособности клеток, а ее недостаток, возникающий из-за недорепликации ДНК, приводит к их гибели из-за отсутствия жизненно важных генов. Однако в природе известны изменения дозы генов в нормальном клеточном цикле или онтогенезе организма. Такие процессы в норме идут под жестким контролем специальных механизмов. Пример деминуции генов наблюдается у аскариды, теряющей в онтогенезе значительное число генов соматических клеток. Устранение генов из состава ДНК приводит к прекращению синтеза всех закодированных в них белков.
2. На уровне транскрипции.

Варианты:

- групповая репрессия генов белками – гистонами;

- амплификация генов - увеличение числа копий заданного участка ДНК или гена. Достигается в результате многократного синтеза ДНК в одном и том же репликативном пузыре. В этом случае транскрипция будет возможна сразу с нескольких копий гена, что увеличивается скорость транскрипции. Эта регуляция изучается у опухолевых клеток, которые способны к амлификации;

- регуляция сигналами-усилителями. Сигналы-усилители - энхансеры - выступающий участок ДНК, который может быть значительно удален от промотора. Под действием энхансера наблюдается более чем 200-кратное увеличение скорости транскрипции. Действует неспецифично, усиливая транскрипцию многих генов.

Пр.: действие гормонов коры надпочечников: глюкокортикоиды проникают внутрь клетки, где взаимодействуют с рецептором, посредством чего проникают в ядро, где присоединяются к ДНК и превращают участок ДНК в энхансер. При этом запускается синтез ферментов, характерных для действия глюкокортикоидов. Данный механизм работает только у эукариот.

3. регуляция на уровне процессинга иРНК:

- разрешение или запрещение процессинга. Так, не все пре-иРНК превращаются в зрелые иРНК: пре-иРНК ®иРНК;

- дифференциальный (альтернативный) процессинг. В клетках эукариот возможен многовариантный процессинг,