Колориметрические (фотометрические) методы

Колориметрические методы определения общего белка основаны на цветных реакциях белков с хромоген-образующими реактивами или на неспецифическом связывании красителя.

Среди колориметрических методов определения концентрации общего белка сыворотки наиболее распространенным считается биуретовый метод, основанный на так называемой «цветной биуретовой реакции», в ходе которой белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет, интенсивность окраски зависит от концентрации общего белка в сыворотке. Биуретовый метод определения общего белка в сыворотке крови был утвержден в качестве унифицированного в 1972 г.

Колориметрические методы определения общего белка сыворотки крови достаточно просты и относительно дешевы. К недостатку метода относится интерферирующее действие некоторых веществ (в том числе лекарств).

Нормальное количество общего белка в сыворотке крови колеблется от 60 до 80 г/л. Плазма содержит на 2-4 г/л больше за счет фибриногена, который отсутствует в сыворотке.

Пониженная концентрация белков в крови называется гипопротеинемия, повышенная – гиперпротеинемия.

Причины гипопротеинемии:

- недостаточное введение белка (длительное голодание, безбелковая диета);

- повышенная потеря белка (при различных заболеваниях почек, кровопотерях, ожогах, новообразованиях, асцитах, сахарном диабете);

- нарушение образования белка в организме: при недостаточности функции печени (гепатиты, циррозы, токсические повреждения), длительном лечении кортикостероидами, нарушении всасывания (при энтеритах, энтероколитах, панкреатитах).

Гиперпротеинемия наблюдается при:

- дегидратации в результате потери части внутрисосудистой жидкости (при тяжелых травмах, обширных ожогах, холере);

- появлении в крови парапротеинов – патологических белков, вырабатываемых в большом количестве при миеломной болезни, при болезни Вальденстрема).

 

С помощью электрофореза на бумаге выделяют 5 стандартных фракций: альбумины и четыре фракции глобулинов (α1-глобулины, α2-глобулины, β-глобулины, γ-глобулины).

Принцип электрофореза белков заключается в следующем:

Ацетатцеллюлозная пленка, гель, специальная бумага (носитель) помещается на рамку, при этом противоположные края носителя свисают в кюветы с буферным раствором. На линию старта наносится сыворотка крови. Метод заключается в движении буферного раствора по поверхности носителя под влиянием электрического поля. Двигаясь, буферный раствор захватывает молекулы белков сыворотки. Молекулы с наибольшим отрицательным зарядом и наименьшим размером, т.е. альбумины, двигаются быстрее остальных. Наиболее крупные и нейтральные (γ-глобулины) оказываются последними.

На ход электрофореза влияет подвижность разделяемых веществ, находящаяся в зависимости от следующих факторов: заряда (обычно зависит от pH), размера и формы молекул веществ, электрического поля, буфера и носителя (учитывается его гидрофильность и адсорбционная способность).

 

 

Общий вид электрофореза

 

Количество выделяемых фракций определяется условиями проведения электрофореза. При электрофорезе на бумаге и пленках ацетата целлюлозы в клинико-диагностических лабораториях выделяют 5 стандартных фракций, в то время как в полиакриламидном геле – до 20 и более фракций. При использовании более совершенных методов (радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и других) в составе глобулиновых фракций выявляются многочисленные индивидуальные белки.

 

Электрофореграмма (вверху) и графический результат ее обработки (внизу)

 

На вид протеинограммы оказывают влияние только те белки, концентрация которых достаточно высока.

Нормальная протеинограмма

Альбумины	52-65 %	35-50 г/л
α1-Глобулины	2,5-5 %	1-3 г/л
α2-Глобулины	7-13 %	6-10 г/л
β-Глобулины	8-14 %	7-11 г/л
γ-Глобулины	12-22 %	8-16 г/л

 

Альбуминовая фракция включает в себя альбумин (основная часть) и преальбумин – ее доля составляет более 50% от всех белков плазмы.

Глобулиновые фракции более разнородны.

Фракция альфа1-глобулина включает в себя следующие белки:

- α1-антитрипсин (основной компонент этой фракции) - ингибитор многих протеолитических ферментов - трипсина, химотрипсина, плазмина и.т.д.

- α1-липопротеин (ЛПВП) - участвует в транспорте липидов.

- α1-кислый гликопротеин (орозомукоид). Он повышается в ответ на различные острые и хронические воспалительные стимулы. Используется для индикации острофазового ответа.

Фракция альфа2-глобулинов включает:

- α2-макроглобулин (основной компонент фракции) – является регулятором иммунной системы и участвует в развитии инфекционных и воспалительных реакций.

- Гаптоглобин - это гликопротеин, который образует комплекс с гемоглобином, высвобождающимся из эритроцитов при внутрисосудистом гемолизе, утилизирующийся затем клетками ретикулоэндотелиальной системы, что необходимо для предотвращения потерь железа и повреждения почек гемоглобином.

- Церулоплазмин - специфически связывает ионы меди, а также является оксидазой аскорбиновой кислоты, адреналина, диоксифенилаланина (ДОФА), способен инактивировать свободные радикалы. При низком содержании церулоплазина (болезнь Вильсона-Коновалова) происходит накопление меди в печени (вызывая цирроз) и в базальных ганглиях мозга (причина хореоатетоза). Увеличение содержания церулоплазмина специфично для меланомы и шизофрении.

- Аполипопротеин В - участвуют в транспорте липидов.

Фракция бета-глобулинов включает:

- Трансферрин – белок, который осуществляет транспорт железа, тем самым, предотвращая накопление ионов железа в тканях и потерю его с мочой.

- Гемопексин - связывает гемм и предотвращает его выведение почками.

- Компоненты комплемента - участвуют в реакциях иммунитета.

- β-липопротеин - участвует в транспорте холестерина и фосфолипидов.

Фракция гамма-глобулинов состоит из иммуноглобулинов, (IgG, IgA, IgM, IgE), функционально представляющих собой антитела, обеспечивающие гуморальную иммунную защиту организма от инфекций и чужеродных веществ.

Диспротеинемия – нарушение нормального соотношения фракций белков плазмы, встречается при многих заболеваниях, значительно чаще, чем изменение общего количества белка. Диспротеинемии обладают большой динамикой, связанной с фазой развития процесса, его длительностью и интенсивностью проводимых лечебных мероприятий.

Типы протеинограмм

В клинической практике для сыворотки выделяют 10 типов электрофореграмм (протеинограмм), соответствующих различным патологическим состояниям:

 

Тип протеинограммы	Альбумины	Фракции глобулинов	Примеры заболеваний
α1	α2	β	γ
Острые воспаления	↓↓	↑	↑	—	↑	Начальные стадии пневмоний, острые полиартриты, экссудативный туберкулез легких, острые инфекционные заболевания, сепсис, инфаркт миокарда
Хронические воспаления	↓	—	↑↑	—	↑↑	Поздние стадии пневмоний, хронический туберкулез легких, хронический эндокардит, холецистит, цистит и пиелит
Нарушения почечного фильтра	↓↓	—	↑	↑	↓	Генуинный, липоидный или амилоидный нефроз, нефрит, нефросклероз, токсикоз беременности, терминальные стадии туберкулеза легких, кахексии
Злокачествен- ные опухоли	↓↓	↑↑	↑↑	↑↑↑	↑↑	Метастатические новообразования с различной локализацией первичной опухоли
Гепатиты	↓	—	—	↑	↑↑	Последствия токсического повреждения печени, гепатиты, гемолитические процессы, лейкемии, злокачественные новообразования кроветворного и лимфатического аппарата, некоторые формы полиартрита, дерматозы
Некроз печени	↓↓	—	↓	↑	↑↑	Цирроз печени, тяжелые формы индуративного туберкулеза легких, некоторые формы хронического полиартрита и коллагенозов
Механические желтухи	↓	—	↑	↑	↑	Обтурационная желтуха, желтухи, вызванные развитием рака желчевыводящих путей и головки поджелудочной железы
α2-глобулиновые плазмоцитомы	↓	↓	↑↑	↓	↓	α2-Плазмоцитомы
β-глобулиновые плазмоцитомы	↓	↓	↓	↑↑	↓	β1-Плазмоцитомы, β1-плазмоклеточная лейкемия и макроглобулинемия Вальденштрема
γ-глобулиновые плазмоцитомы	↓	↓	↓	↓	↑↑	γ-Плазмоцитомы, макроглобулинемия и некоторые ретикулезы

Для интегральной оценки протеинограмм используется А/Г коэффициент (альбумино-глобулиновое соотношение), составляющий в норме 1 – 2 отн. ед.

Белки острой фазы (БОФ) – большая группа белков сыворотки крови, синтезирующаяся в печени, концентрация которых возрастает при наличии воспаления, сдавления, ожога, бактериальной или вирусной инфекции.

Классификация БОФ по степени увеличения их концентрации

В сыворотки крови

Группы БОФ	Степень увеличения концентрации БОФ	БОФ	Концентрация в сыворотке крови здорового человека (г/л)
1 гуппа	«Главные» БОФ, уровень которых возрастает при повреждении очень быстро (в первые 6-8 часов) и значительно (в 20-100 раз, в отдельных случаях - в 1000 раз).	С-реактивный белок (СРБ)	< 0,005
Амилоидный белок А сыворотки
2 гуппа	Белки, концентрация которых может умеренно увеличиваться (в 2-5 раз) в течении 24 ч	Орозомукоид (кислый α-гликопротеид)	0,4 - 1,3
α- Антитрипсин	1,4 - 3,2
Гаптоглобин	0,5 - 3,2
Фибриноген	1,8 - 3,5 (плазма)
3 группа	Незначительное увеличение концентрации (на 20 - 60%) в течение 48ч	Церулоплазмин	0,2 - 0,5
C3 - комплект	0,5 - 0,9
C4 - комплект	0,1 - 0,4
4 группа	Нейтральные БОФ (белки, концентрация которых может оставаться в пределах нормальных значений, однако они принимают участие в реакциях острой фазы воспаления).	Иммуноглобулин G	8 - 20
Иммуноглобулин A	0,9 - 4,5
Иммуноглобулин M	0,6 - 2,5
α2-Макроглобулин	1,2 - 3,2
5 группа	"Негативные" БОФ, уровень может снижаться на 30-60 % в течение 12 - 18 ч	Альбумин	37 - 53
Трансферрин	2,3 - 4,3
Преальбумин	0,25 - 0,45

 

Данные белки запускают каскад реакций для отграничения воспалительного очага, от неповрежденных тканей, восстановление нарушенной структуры и функции.

Синтез белков острой фазы активируется под действием провоспалительных цитокинов (интерлейкины — 1, 6, 11, факторы некроза опу­холей, γ-интерферон).

Особенностью большинства БОФ является их неспецифичность и высокая корреляция концентраций в крови с активностью заболевания, стадией процесса и массивностью повреждения, что и определяет ценность этих тестов для мониторинга течения заболеваний и контроля эффективности лечения. Изменение концентрации различных белков в условиях повреждения и воспаления варьирует в широких пределах.

Основные методы, используемые для определения БОФ, следующие:

1.Инструментальные: нефелометрия, иммунотурбидиметрия.

Эти два метода примерно равноценны по чувствительности, специфичности, трудоемкости и стоимости исследования. Серийность и автоматизация исследований делает эти методы оптимальными для больших и средних лабораторий, выполняющих десятки и сотни анализов в день.

2. Методы, не требующие оборудования: радиальная иммунодиффузия.
Полностью готовые к употреблению иммунодиффузионные планшеты позволяют проводить количественный анализ С-реактивного белка и других белков ОФ без приборов и дополнительных реагентов. Они рекомендованы для небольших лабораторий, выполняющих ограниченное число исследований (от одного до 20 анализов) в день.

3. Латекс-агглютинация может использоваться как быстрый полуколичественный метод определения С-реактивного белка. Его назначение - скрининг повышенных концентраций, после чего следует перейти к мониторингу с использованием количественных методов.