Азотистые соединения и витамины

В молоке азотистые соединения представлены белками – казеи­ном (около 85% от общего количества белков), лактоальбумином (до 13%) и лактоглобулином (около 2%), а также липопротеином оболочек жировых шариков (небольшое количество). Из небелковых азотистых соединений в молоке содержатся мочевина, креатин, креатинин, мочевая кислота, пуриновые основания, аммиак, гиппуровая кислота, аминокислоты и пептоны. Количество небелкового азота в молоке составляет около 0,05% (Г. С. Инихов, 1970). Содержание свободных аминокислот в молоке незначительно – от 0,5 до 2 мг%. Различные исследователи обнаруживали в нем аргинин, гистидин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, глютаминовую кислоту, пролин, треонин, аспарагиновую кислоту, серии. Последние две аминокислоты присутствуют в очень небольшом количестве (Л. Дейч и Е. Самуэльсон, 1959; Р. Дж. Блок, 1951). Исследования Э. Е. Грудзинской и Н. С. Королевой (1970) также показали наличие в молоке метионина и тирозина. Р. Дж. Блоком (1951) и В. Ц. Зантом и Ф. Е. Нельсоном (19536) в безбелковои фракции обезжиренного молока обнаружены три пептида. Азотистые соединения молока служат источником питания микро­организмов. Возможность и интенсивность развития молочнокислых бактерий зависят прежде всего от их потребностей в тех или иных источниках питания, наличия нужных веществ в молоке в свободном виде и имеющегося набора ферментов для разложения и усвоения этих веществ. Чем более выражена способность микроорганизмов к протеолизу, тем меньше влияют на микроорганизмы различные коле­бания в составе молока.

Требования, предъявляемые молочнокислыми бактериями к азотис­тому составу среды, были впервые исследованы С. Орла-Йенсеном с сотрудниками (1936). Им была установлена потребность молочно­кислых бактерий в отдельных аминокислотах и стимуляция их роста при добавлении различных естественных экстрактов (дрожжевого автолизата, печеночного экстракта и пр.). Он отметил, что потреб­ность в дополнительных источниках азотного питания у термобакте­рий выше, чем у стрептобактерий и стрептококков. В зависимости от потребности в различных источниках азота С. Орла-Йенсен разделил молочнокислые бактерии на три группы:

бактерии, нуждающиеся в сложном комплексе аминокислот и вита­минах (род Thermobacterium); бактерии, хорошо развивающиеся на цистеине и на аммонийных со­лях (род Streptobacterium); бактерии, которые могут развиваться на аммонийных солях в качест­ве единственного источника азота (род Streptococcus).

Пептоны. Добавление пептонов к молоку и молочной сыворотке уси­ливает рост многих штаммов молочнокислых стрептококков (Str. lactis и Str. cremoris) и некоторых палочек (X. Уолкер, 1957). Пеп­тоны используются молочнокислыми бактериями (Т. Дульман, 1937, 1939), однако на средах, содержащих в качестве единственного ис­точника азота пептон, большинство молочнокислых бактерий, осо­бенно палочек, но дает максимального роста (С. А. Королев, 1932, А. М. Скородумова, 1962).

. Пептиды. Установлено, что некоторые пептиды способствуют росту молочнокислых бактерий в значительно большей степени, чем экви­валентные количества аминокислот, входящих в их состав. В то вре­мя как структурно-близкие аминокислоты могли оказывать угнетаю­щее воздействие, если количество их в среде не было строго сбалан­сировано, с пептидами такого явления не наблюдалось (Б. Рпйтер и А. Моллер-Мадсен, 1963). Очищенные пептиды оказывают замет­ное стимулирующее действие на Str. lactis, Str. cremoris, Lbm. casei.

 

 

По-видимому, стимулирующий эффект ферментативных гидролизатов казеина можно Аминокислоты. А. В. Андерсон и Р. П. Элликер (1953), изучая по­требности молочнокислых бактерий в отдельных аминокислотах, по­казали, что большинству из них для максимального роста требова­лось, по крайней мере, 16 аминокислот. По данным этих авторов, а также Б. Рийтера и Дж. Орам (1962), для Str. lactis и Str. cremoris необходимы пролин, глютамин и глютаминовая кислота, валин, ме-тионин, лейцин, изолейцин, гистидин. Кроме того, для развития Str. cremoris требовались фенилаланин и аргинин.

Для развития большинства штаммов Str. cremoris требовался более разнообразный набор аминокислот. Лишь немногие штаммы Str. cremoris нуждались в цистине, триптофане, аспарагиновой кислоте, тирозине и серине. Для всех культур Str. lactis и Str. diacetilactis и для большей части Str. cremoris эти аминокислоты можно было полностью исключить из среды.

В отличие от Str. lactis, Str. diacetilactis и Str. cremoris, ароматообра-зующие стрептококки Leuc. citrovorum и Leiic. dextranicum нужда­лись в триптофане, но лишь немногие из них требовали пролин. По­требность в остальных аминокислотах была такой же, как и у Str. lactis, Str. cremoris и Str. diacetilactis. Культуры Str. lactis var. mal-tigenes, придающие молоку, в котором они развиваются, солодовый привкус, нуждаются в лейцине, изолейцине и валине (Е. X. Март, 1962). Из свободного лейцина образуется 3-метилбутанол, наличие которого и обусловливает появление солодового привкуса (X. Лесмент, 1960, А. Моллер-Мадсен и X. Йенсен, 1962). По данным Нур-мико (цитируется по Е. А. Ждановой и П. Ф. Дьяченко, 1962), по­требность Str. thermophilus в аминокислотах зависела от наличия в среде кальция. Глютаминовая кислота и цистин были нужны для всех штаммов, гистидин и триптофан – лишь для очень немногих. Валин, глицин, треонин, метионин и изолейцин требовались для большинства штаммов в среде, не содержащей кальция; в присутст­вии же кальция они оказывали угнетающее действие па эти микро­организмы. Влияние аспарагинопой кислоты, лейцина, аланина, ти­розина и триптофана также зависело от содержания в среде кальция.

Э. С. Батиста, Р. С. Дехайя и М. Л. Спекк (1966) установили, что основными факторами роста термофильного стрептококка являют­ся глицин и гистидин. Э. Е. Грудзинской (1970) было показано, что термофильный стрептококк при совместном развитии в молоке с болгарской палочкой почти полностью потребляет в первые часы серии, глицин, глютаминовую кислоту, аланин, тиро­зин, метионин и валин. Установлено, что серин угнетающе действует на развитие многих стрептококков в синтетических питательных средах. В некоторых случаях токсичность серина можно было уменьшить добавлением значительного количества аланина. То же самое наблюдалось и в отношении метионина, ингибиторное действие которого снижалось при добавлении треонина (М. Л. Спекк, 1962). Этим, вероятно, можно объяснить, почему отсутствует угнетение молочно­кислых стрептококков, если молоко обогащается смесью аминокис­лот, содержащихся в гидролизатах белка или субстратах. Приведен­ные данные свидетельствуют также об исключительной важности правильного сбалансирования содержания различных аминокислот при составлении синтетических сред для развития молочнокислых бактерий.

Пуриновые и пиримидиновые основания, нуклеиновые кислоты. Раз­виваясь в молоке, молочнокислые бактерии испытывают меньший недостаток в аминокислотах, чем, например, в пуриновых и пирими-диновых основаниях и нуклеиновых кислотах (Ц. Н. Хьютанен и В. Л. Вильяме, 1963). В молоке этих соединений недостаточно, по­этому при добавлении их усиливается кислотообразование молочно­кислых бактерий. Особенно большой эффект наблюдался при добав­лении инозина. Р. С. Дехайя и М. Л. Спекк (1962) установили, что некоторые слабые штаммы Str. lactis вырабатывают вещество, сти­мулирующее развитие сильных рас. Это вещество было идентифици­ровано как аденин. Чистый аденин обладал темп же свойствами и при добавлении к молоку стимулировал рост энергичных культур Str. lactis и Str. cremoris. Некоторые пуриновые основания, в частности гуанин и ксантин, мо­гут угнетающе действовать на молочнокислые палочки (В. Боттацци, 1962). Это действие уменьшается в присутствии аденина и гипоксантина. Таким образом, аденин является, по-видимому, наиболее важ­ным из пуринов в азотном питании молочнокислых бактерий. Активация, оказываемая на микроорганизмы заквасок экстрактом панкреатиновой железы, объясняется наличием в нем инозина, гипоксантина и аденина. По-видимому, здесь нельзя не учитывать и протеолитического действия, которое оказывает панкреатин на белки молока.

Витамины. Молочнокислые бактерии проявляют довольно высокую требовательность к наличию ряда витаминов в питательной среде. Многие микроорганизмы, например, дрожжи, уксуснокислые, пропионовокислые бактерии, способны синтезировать витамины. Молочнокислые стрептококки (Str. lactis, Str. cremoris, Str. diacetilac-tis) испытывают потребность в никотиновой кислоте, ниацине и био­тине. Не требуются для этих микроорганизмов тиамин, фолиевая кис­лота и Bi2. Пиридоксаль стимулирует их развитие. Рибофлавин ну­жен только Str. cremoris (Б. Рийтер и А. Моллер-Мадсен, 1963; Ц. Ф. Нивен, 1944). По данным А. Андерсона и П. Р. Элликера (1953), тиамин и фолевая кислота все же оказывали стимулирую­щее действие на большинство исследованных ими штаммов стрепто­кокков. Возможно, что такое расхождение в результате объясняется различной сбалансированностью использованных сред. Потребности молочнокислых бактерий в витаминах для роста и об­разования ароматических веществ различны. Так, по данным С. Анан-тарамаиаха, Ц. Анантакришнана и К. Йя (1962), Leuc. citrovorum хорошо развивались при отсутствии тиамина, но не могли без него образовывать ацетоин. При отсутствии пантотената кальция эти мик­роорганизмы плохо росли, но хорошо продуцировали ацетоин. Те же результаты были получены с никотиновой кислотой. Это очень важ­но учитывать при выборе состава среды. С. Орла-Йенсен с сотрудника­ми (1936а) установил, что молочнокислые бактерии ощущают наи­большую потребность в витаминах группы В. Этот факт подтверж­ден также М. Непомнящей, М. Тевелевич (1955), Я. Черна, Я. Пи­ковой, Я. Блаттна (1972) и другими авторами. В натуральном моло­ке содержатся почти все витамины этой группы. Стимуляцию раз­вития молочнокислых бактерий при добавлении к молоку дрожже­вого автолизата либо растительных экстрактов можно объяснить наличием в них витаминов группы В или неизвестных факторов роста. Усиление развития молочнокислых бактерий при совместном культивировании с дрожжами, уксуснокислыми бактериями и други­ми микроорганизмами в какой-то степени, несомненно, связано со способностью дрожжей и уксуснокислых бактерий к синтезу вита­минов.

Для большинства штаммов Str. thermophilus требуются рибофлавин, биотип, пантотеновая и никотиновая кислоты. Стимулирующее дей­ствие оказывали также тиамин и пиридоксаль (Б. Рийтер и А. Мол-лер-Мадсен, 1963). М. Е. Шарп (1962) установила, что для развития молочнокислых палочек большое значение имеет концентрация фолевой кислоты в среде. Для развития молочнокислых бактерий в молоке наибольшее значение как источник энергии имеет лактоза. Эти микроорганизмы предварительно расщепляют лактазу на глюкозу и галактозу. Преж­де чем галактоза может быть использована организмом, она должна быть превращена в форму глюкозы (В. Е. Сандин и др., 1962). Это превращение осуществляется в результате реакций фосфорилирования, конечным продуктом которых является глюкозо-1-фосфат, под­вергающийся в дальнейшем брожению по той же схеме, что и глю­коза. Молочнокислые бактерии по характеру продуктов брожения делят на гомоферментативные и гетероферментативные. Гомоферментативное молочнокислое брожение характеризуется количествен­ным превращением сбраживаемых углеводов в молочную кислоту, выход которой достигает 98–98,6%.

Гомоферментативные молочнокислые бактерии почти не используют углеводы в конструктивном обмене, который осуществляется в основ­ном за счет использования готовых аминокислот субстрата. Гетероферментативные молочнокислые бактерии обладают фермен­тами, необходимыми для прямого окисления и декарбоксилировапия промежуточных продуктов брожения. Однако в их ферментной системе нет альдолазы и триозофосфатизомеразы. Поэтому они не могут проводить молочнокислое брожение по гексозодифосфатной схеме и образуют из глюкозы, кроме молочной кислоты, приблизительно в эквимолекулярных количествах этиловый спирт, уксусную кисло­ту, углекислый газ, а также ряд других побочных продуктов. Считается, что способность молочнокислых бактерий образовывать ферменты, свойственные лишь одному из метаболитических путей (гексозомонофосфатному или гексозодифосфатному), служит энзиматпческой основой для их разделения на гетероферментативные и гомоферментативные (И. И. Климовский, 1966, и др.). Однако, по-видимому, это положение может быть в дальнейшем подвергнуто корректировке. Так, Р. Нандан (1969), изучая метаболизм Str. diacetilactis, Str. cremoris и Str. lactis, установил, что все эти микроорга­низмы способны доводить до конца декарбоксилирование пирувата и других а-кетокислот. На основании этих данных он высказывает сомнение в целесообразности отнесения этих микробов к строго го-моферментативной группе.

Наиболее ценными побочными продуктами молочнокислого брожения являются ацетоин, ацетальдегид и особенно диацетил. Существуют разные мнения об источниках, из которых получаются эти вещества. Установлено, что при добавлении к среде лимонной кислоты образо­вание диацетила и ацетоина усиливается. Однако ни глюкоза, ни лимонная кислота, добавленные к среде в отдельности, не влияют на образование диацетила. Диацетил (СНз–СО–СО–СН₃)–более окисленная форма, чем аце­тоин (СН₃–СНОН–СО–СН₃). По данным А. К. Максимовой (1954), он может накапливаться лишь в закваске, обладающей сла­быми редуцирующими свойствами, где не создаются условия для вос­становления диацетила в ацетоин. При быстром снижении окисли­тельно-восстановительного потенциала содержание диацетила в куль­туре резко падает. Кроме того, установлено, что для накопления диацетила культурами Str. diacetilactis необходимы определенные ус­ловия среды: присутствие в среде цитрата; рН около 4,5–4,4; темпе­ратура 25° С. На образование диацетила существенно влияет режим тепловой обработки молока. Снижение окислительно-восстановитель­ного потенциала, связанное с образованием сульфгидрильных групп – SH, приводит к уменьшению содержания диацетила в за­кваске (А. К. Максимова, 1954). В результате аэрации (перемеши­вания) закваски в процессе сквашивания усиливалось образование диацетила и создавались более окисленные условия среды. Исследования А. Свенсена (1970) показали, что в процессе развития закваски, состоящей из Str. lactis, Str. cremoris и Leuconostoc, в ней накапливаются диацетил, ацетальдегид, ацетон, этиловый спирт и ацетоин. Максимальное количество всех ароматических веществ в закваске обнаруживалось через 12–18 ч после заквашивания; че­рез 18 ч образовывалось 6–10 мг/кг диацетила, через 12 ч 7–2 мг/кг ацетальдегида, через 18 и 24 ч 0,86–0,92 мг/кг ацетона, через' 72 ч – 28–30 мг/кг этилового спирта, через 18 ч 161–76 мг/кг ацетона. В дальнейшем начиналось снижение их количества. Исключение составляет этиловый спирт, содержание которого продолжало повы­шаться за весь период наблюдения (72 ч). Как видно из приведен­ных данных, для закваски этого типа преобладающим побочным веществом был ацетоин, диацетила содержалось примерно в 10 раз меньше. В. Пало и В. Кохова (1969), исследуя закваску для сква­шивания сливок, установили, что ненормально высокое содержание в ней ацетальдегида и этилового спирта сопровождалось появлением пороков вкуса и аромата.

Основным побочным продуктом брожения термофильных молочно­кислых палочек (Lbm. bulgaricum) является ацетальдегид (И. В. Петте и X. Лолкема, 19506, М. Шульц и Г. Хингст, 1954; Ф. Горнер, В. Пало, М. Сегинова, 1972). При этом в первые часы сквашивания йогурта накопление ацетальдегида происходит одновременно с на­коплением молочной кислоты. Выдержка продукта после образования сгустка при 45° С приводила к снижению ацетальдегида через 4–5 ч. Хранение продукта после сквашивания на холоду позволяло поддер­живать содержание ацетальдегида в нем на первоначальном уровне в течение 18 ч после сквашивания (Е. В. Мельникова, 1973).

Жиры и жирные кислоты

Долгое время считалось, что жир не требуется для развития молоч­нокислых бактерий, так как они одинаково хорошо растут и в цель­ном, и в обезжиренном молоке. Однако исследования С. Е. Джиллиланда и X. Ц. Ольсона (1963) показали, что в первые 10–12 ч раз­вития молочнокислых бактерий в цельном молоке отмечалось более быстрое кислотообразование, чем в обезжиренном. При добавлении к обезжиренному молоку цельного или пахты в соотношении 1: 1 ускорялось кислотообразование в этой среде. Авторы предполагают, что вещество, стимулирующее кислотообразование, содержится в липопротеиновых оболочках жировых шариков. Пастеризация не сни­жала стимулирующего действия. Практически заметной разницы в энергии кислотообразования молочнокислых бактерий при изготов­лении заквасок на цельном и обезжиренном молоке не наблюдается. Отмечено, что в молоке, подвергнутом значительному лпполизу, по­верхностное натяжение снижается, в результате чего угнетается раз­витие молочнокислых стрептококков. Повышенная активность фер­мента липазы в молоке характерна для раннего периода лактации. Жир в молоке разлагается также вследствие развития липолптпче-ских микроорганизмов. В результате пастеризации молока липолпти-ческие микроорганизмы погибают и липаза инактивируется. При добавлении прогорклого молока к нормальному молочнокислый процесс замедлялся, снижалось образование аромата. Степень замед­ления свертывания молока находилась в прямой зависимости от ко­личества прогорклого молока (Ф. Дж. Бэбел, 1955). В дальнейшем было выяснено, что подавление развития молочнокис­лых бактерий в прогорклом молоке обусловлено не только снижени­ем поверхностного натяжения, но и наличием в нем свободных жпр-ных кислот или их солей, часть из которых оказывает на стрептококков токсическое действие. Установлено, что каприловая, каприновая и лауриновая кислоты в количестве 0,1% угнетали развитие молоч­нокислых стрептококков, причем степень подавления их возрастала с увеличением концентрации этих кислот в среде. Масляная, лино-левая, линоленовая, арахидиновая и пальмитиновая кислоты в та­ком же количестве не оказывали угнетающего действия. При добав­лении 0,5% стеариновой кислоты почти полностью прекращалось кислотообразование у Str. lactis (Ф. Дж. Бэбел, 1962). Имеются ука­зания о стимуляции развития некоторых молочнокислых стрептокок­ков и палочек олеиновой кислотой (Е. М. Фостер и др., 1961). Прак­тически свободные жирные кислоты и их соли не влияют существен­но на энергию кислотообразования молочнокислых бактерий при производстве кисломолочных продуктов, так как обычно в молоке содержится незначительное количество их. Угнетающее действие свободных жирных кислот можно снизить, внеся повышенное (5%) количество закваски (Ф. Дж. Бэбел, 1955). Липазная активность молочнокислых бактерий очень мала по сравнению с другими типичными липолитическими микроорганизмами. Вряд ли она может играть существенную роль при производстве кисломолочных продуктов.

Некоторые немолочнокислые микроорганизмы молока, например Oidium lactis, обладают способностью активно использовать молоч­ный жир и свободные жирные кислоты в процессе обмена веществ. При наличии на поверхности сквашенного молока слоя сливок со­здаются благоприятные условия для развития молочной плесени. Поэтому при культивировании кефирных грибков, где есть опасность их плесневения, целесообразнее использовать обезжиренное молоко.

Соли и микроэлементы

Содержание поваренной соли в молоке в концентрации 0,5–1,0% ускоряет развитие стрептококков, в концентрации 5% –заметно по­давляет. Различную устойчивость отдельных видов стрептококков к действию поваренной соли используют для дифференциации видов. Так, энтерококки развиваются при содержании в среде 6,5% NaCl; ацидофильная и бол­гарская палочки –до 2%; термоустойчивые палочки –2–3%. Другие виды молочнокислых бактерий не могут расти при концентрации со­ли более 1–2%.

По данным И. Рашича, Б. Обрадовича и С. Митича (1965), присут­ствие пептона в среде снижает ингибирующее действие поваренной соли в концентрации 4–6,5% на рост Str. diacetilactis и Leuconostoc. Методом замещения ионов в молоке установлено, что молочнокислые бактерии больше всего нуждаются в магнии и натрии, причем магний не может быть заменен кальцием. В результате удаления из молока железа энергия кислотообразования заквасок несколько снижалась, но при замене железа кобальтом и цинком она восстанавливалась (Б. Рийтер и А. Моллер-Мадсен, 1963). Т. Гелслоот и Ф. Хассинг (1962 г) установили, что кальций необходим для развития заква­сок, содержащих в качестве ароматообразователей виды Leuconostoc. Str. diacetilactis развивался в декальцинированной среде нормально. Магний стимулировал образование диацетила культурами Leucono­stoc, но не влиял на Str. diacetilactis.

При добавлении к молоку марганца устранялось сезонное влияние состава молока на развитие ароматообразующих бактерий (Т. Гел­слоот, Ф. Хассинг, 1962а).

Впоследствии И. С. Йенсен, А. И. Оверби (1970) подтвердили, что, добавляя 0,24 мг Ма⁺⁺ на 1 л молока, можно после нескольких пас­сажей повысить в комбинированной закваске содержание аромато­образующих стрептококков Leuc. citrovorum. Однако, как показали исследования Е. Андерсона и X. Лесмента (1970), стимулирование развития Leuc. citrovorum при добавлении марганца приводило к раннему сбраживанию лимонной кислоты и почти полному восста­новлению четырехуглеродных соединений до 2,3-бутилен-гликоля, а следовательно, к исчезновению аромата