Молочнокислые палочки, гомоферментативные молочнокислые палочки

Lbm. Bulgaricum (Bacillus (Lactobacillus) bulgaricus, Thertnobacterhim bulgaricum (Orla–Jensen, 1936) Bacterium bulgaricum.

Болгарская палочка выделена Григоровым и Коэндп из болгарского кислого молока в 1905 г. Форма клеток в молоке – длинные и короткие палочки от 5 до 20 мк, толщиной1–1,5 мк. Красятся по Граму, спор не образуют. При окрашивании препаратов из молока метиленовым голубым в клетках часто наблюдаются четко выраженные метахроматические зерна, иногда неравномерно окрашенные участки протоплазмы. На плотных питательных средах образуют колонии: поверхностные – более или менее крупные (диаметром 1,5–3 мм), локонообразные, светлые; глубинпые – в виде кусочков ваты (“паучки”). Оптимальная температура развития 40–45° С, максимальная 60– 62° С, минимальная 20° С. При внесении петлей в пробирку с моло­ком свертывают его при оптимальной температуре за 8–12 ч. Уже через 12–14 ч после заквашивания кислотность нередко достигает 120–160° Т, через 7 суток 200–350° Т. В молоке образуют преиму­щественно D (–) или DL молочную кислоту, иногда в небольшом ко­личестве летучие кислоты.

Некоторые штаммы болгарской палочки образуют также ацетальдегид, который придает продуктам специфический вкус и аромат и антибиотические вещества, подавляющие нежелательную микрофлору (П. Риттер, 1964, Л. Начев, Ц. Никоевска, 1969, В. Боттацци, М. Бескове, 1969. Е. В. Мельникова, 1973). Болгарскую палочку в сочетании с термофильным стрептококком применяют в качестве энергичного кислотообразователя для улучше­ния вкуса и аромата при производстве южной и мечниковской про­стокваши, а также йогурта и ряженки.

Lbm. acidophilum–ацидофильная палочка. Синонимы Bacillus (Lactobacillus) acidophilus Moro (1900) Thermobacterium intestinale Orla–Jensen a. Winter (1936), Bacterium acidophilum.

В мировой литературе нет единого мнения о морфолого-культуральных и биохимическпх свойствах этого микроба. Впервые микроб под названием Bacillus acidophilus был выделен Моро из faeces грудного ребенка в 1900 г. Если описание, данное Григоровым выделенной им болгар­ской палочке, более или менее соответствует современной характе­ристике этого микроорганизма, то микроб, выделенный Моро, не име­ет ничего общего с применяемыми в настоящее время ацидофильны­ми бактериями. Об этом свидетельствует прежде всего анализ дан­ных об энергии кислотообразования этих микроорганизмов. Не менее разнообразны описания и других свойств ацидофильных бактерий: размеров клеток (короткие, тонкие или длинные, более толстые), формы колоний (R- или S-форма), сбраживание сахаров (способность сбраживать мальтозу или отсутствие этой способности). Такое разнообразие взглядов, как нам кажется, можно объяснить следующими обстоятельствами.

Применение молочнокислых бактерий для приготовления кисломо­лочных продуктов возможно только в том случае, если они более или менее активно свертывают молоко. Бактерии, выделенные Моро и другими ранними исследователями, были не пригодны для указан­ной цели. Поэтому дальнейшие усилия были направлены на выде­ление из кишечника более активных в отношении кислотообразова­ния микробов. Впервые такие микроорганизмы, свертывавшие моло­ко за 24 ч, были выделены Ретжером в 1922 г. и успеш­но применены ими и Н. Копеловым в клинических испытаниях. За рубежом не делалось попыток выделить более активные по энергии кислотообразования бактерии; в современной литературе они также характеризуются как сравнительно слабые кислотообразователи – свертывают молоко за 24 ч при внесении 0,5% закваски (X. И. Клушп, 1968).

В СССР еще в довоенные годы велись настойчивые поиски ацидо­фильных бактерий – энергичных кислотоообразователей.. Такие куль­туры были выделены они свертывали молоко при внесении петлей за 9–15 ч,а при внесении 3–5% –за 5–6 ч. Исследования, проведенные в 1951–1953 гг., показали, что культуры ацидофильных бактерий, активно свертывающие молоко, существенно отличаются по морфолого-культуральным и биохимическим свойст­вам от слабых кислотообразователей, характеристика которых почти полностью совпадает с описаниями зарубежных авторов: тонкие па­лочки (4–5 мк), колонии S-формы, способность к сбраживанию мальтозы и сахарозы.

В СССР из широкой группы ацидофильных бактерий, имеющих об­щий источник происхождения – кишечник, выделена подгруппа микроорганизмов, характеризующихся довольно определенными при­знаками (В. И. Верещагина, 1946; Н. С. Королева, 1960): форма клеток в молоке – длинные и короткие палочки, от 3 до 40 мк, тол­щиной 1 –1,5 мк, красятся по Граму; у некоторых штам­мов так же, как и у болгарской палочки, наблюдаются метахроматические зерна при окрашивании препаратов метиленовым голубым: на плотных питательных средах образуют колонии: поверхностные – более или менее крупные (диаметром 1,5–3 мм), светлые, локонообразные; глубинные – в виде “паучков”. Оптимальная температура развития 37–38°С, максимальная 60– 62° С, минимальная около 20° С.

При внесении петлей в пробирку с молоком сквашивание при опти­мальной температуре наступает через 10–12 ч. Предельная кислот­ность в молоке 180–300° Т. В молоке образуют молочную кис­лоту. Основным отличительным свойством ацидофильных бактерий явля­ется их антибиотическая активность. Ацидофильные бактерии спо­собны подавлять развитие ряда микроорганизмов, в том числе бакте­рий группы кишечной палочки, дизентерийной, паратифозной и дру­гих. Считалось, что бактерицидным началом молочнокислых бакте­рий, в том число н ацидофильных, является молочная кислота. Од­нако И. И. Мечников еще в 1907 г. на основании работ Г. Д. Белоновского отмечал, что положительное действие болгарской палочки обусловлено не только молочной кислотой, но и особыми вещества­ми, выделяемыми ею (И. И. Мечников, 1964).

Антибиотические свойства у ацидофильных бактерий впервые были обнаружены М. С. Полонской (1952). Она установила, что культуры ацидофильной палочки наряду с молочной кислотой образуют спе­цифические вещества, оказывающие антибиотическое действие на кишечную палочку. Эти вещества термостабильны: не разрушаются даже при кипячении и проходят через бактериальные (мембранные) фильтры. В дальнейшем эти исследователи и М. II. Бибердиева (1958) выявили, что антибиотические вещества, выделяемые ацидофильной палочкой, угнетающе действуют на ряд штаммов кишечной палочки, патогенных представителей бактерий группы кишечной палочки и дизентерийных палочек, гнилостных бакте­рий и ряд других микроорганизмов

Ацидофильные бактерии устойчивы к неблагоприятным воздействи­ям внешней среды – щелочной реакции (рН 8), наличию в среде фенола, солей желчи (20%), NaCl (2%).

Несмотря на такое кажущееся обилие отличительных признаков, на практике трудно дифференцировать имеющиеся штаммы. Это объясняется тем, что свойства, характерные для аци­дофильной палочки, связаны с приспособлением к условиям ее по­стоянного места обитания – кишечнику. На протяжении многих лет существовало мнение, что в результате культивирования ацидофильной палочки в молоке – среде, не свой­ственной для ее обитания, часть ее признаков может утрачиваться и штаммы нельзя отличить от коллекционных культур болгарской палочки. Поэтому некоторые авторы (А. Ф. Войткевич, 1948; С А. Королев, 1932; Н. Копелов, 1926; Б. Менерт, 1960) считали болгарскую палочку разновидностью ацидофильной, утратившей в результате длительного развития в молоке признаки, обусловливаю­щие возможность развития ее в кишечнике. В то же время среди штаммов, выделенных из молочных продуктов и идентифицирован­ных как болгарская палочка, обнаруживают культуры с достаточно высокой антибиотической активностью, устойчивые к неблагоприят­ным условиям (М. С. Полонская, 1964; В. М. Богданов, 1957 и др.). Имеются данные, что ацидофильные бактерии, утратившие часть свойств в результате лабораторного культивирования, попав в ки­шечник, могут вновь их восстановить (Н. Копелов, 1926; К. И. Кудзин, 1936; А. Шмидт-Бурбах, 1956 и др.). Производственно ценные штаммы ацидофильных бактерий применя­ют для приготовления ацидофиль­ных кисломолочных продуктов, кумыса из коровьего молока.

Термоустойчивые молочнокислые палочки. Наряду с термофильны­ми молочнокислыми палочками, вводимыми с заквасками, в кисло­молочных продуктах встречаются термофильные молочнокислые бактерии незаквасочного проис­хождения (Н. С. Королева, 1960, 1961). Их легко обнаружить в та­ких продуктах, как творог и сметана, закваски для которых состоят только из молочнокислых стрептококков. Они имеют следующие морфологические, культурные и биохимические особенности. Клетки – палочковидные, размером 4–10-0,7–0,9 мк, одиночные, часто с резко выраженными зернами внутри; молодые клетки могут быть темноокрашенные, одиночные или в цепочках. Грам-положительны, спор не образуют, неподвижны, микроаэрофилы. Рас­тут на молоке и агаре с гидролизованным молоком; на МПА роста нет. Глубинные колонии темные, желтовато-бурые, иногда с корот­кими отходящими нитями. При поверхностном росте колонии более крупные, локонообразные или зернистые с темным центром. При внесении петлей молоко свертывают за 8–10 ч, образуют пре­дельную кислотность 150–220° Т. Сгусток неслизистый и слизистый, ровный, без газа. В молоке образуют в небольшом количестве лету­чие кислоты. Сбраживают глюкозу, галактозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, левулезу, раффинозу, декстрин с образованием молочной кислоты. Выдерживают кратковременное нагревание в молоке до 85–90° С, иногда выше, что является одним из наиболее важных признаков, отличающих эти микроорганизмы от других видов термофильных мо­лочнокислых палочек. Устойчивы к NaCl (до 2–3%) и желчи (до 30–40%). Некоторые штаммы отличаются значительной антибиотической активностью по отношению к кишечной палочке.

Применяемые в промышленности концентрации дезинфицирующих средств, например активного хлора, малоэффективны по отношению к термоустойчивым палочкам, что затрудняет борьбу с ними. Как нерегулируемая часть микрофлоры кисломолочных продуктов термоустойчивые молочнокислые палочки должны быть отнесены к группе технически вредных бактерий. В результате их жизнедея­тельности происходит интенсивное кислотообразование, приводящее к развитию порока, – излишне кислый вкус. Иногда отдельные штам­мы термоустойчивой палочки могут вызывать тягучесть и нечистый неприятный вкус кисломолочных продуктов.

Термоустойчивые молочнокислые палочки были обнаружены в сыром молоке, поступающем на предприятия, в молоке, пастеризо­ванном при 75° С с выдержкой 15–20 с и при 80–85° С с выдерж­кой 5–10 мин, на технологическом оборудовании, а также в различ­ных кисломолочных продуктах и заквасках.

Результаты микроскопического исследования кисломолочных продук­тов и заквасок свидетельствуют об обильном обсеменении их термо­устойчивыми молочнокислыми палочками. Следует учесть, что методом микроскопирования удается обнаружить палочки лишь в количестве, превышающем десятки тысяч клеток в 1 мл.

Уксуснокислые бактерии

В литературе много лет назад появились сообщения о том, что в мо­лочных продуктах обнаружены бактерии, морфологически похожие на Str. lactis, но отличающиеся от них резко аэробным характером роста, подвижностью и способностью к интенсивному протеолизу мо­лока. Долгое время эта группа микроорганиз­мов упоминалась как подвижные стрептококки (С. А. Королев, 1932), подвижные диплококки (В. М. Богданов, 1937), протеолитические молочнокислые бактерии (М. Р. Гибшман, 1945), 0-мукоидные фор­мы молочнокислых бактерий (О. К. Палладина, 1941).

М. Р. Гибшман (1952), исследуя физиологические особенности этой группы микроорганизмов, пришла к выводу о принадлежности ее к уксуснокислым бактериям Acetobacter aceti. Уксуснокислые бактерии – подвижные перетрихп - клетки палочковидные, часто овальные, одиночные пли соединенные па­рами либо в цепочки; при окрашивании препаратов культур, выращенных в молоке, метиленовым голубым, клетки по морфо­логическим признакам часто не отличаются от молочнокислых стреп­тококков. Размеры клеток колеблются в пределах 0,6–2,5-0,4–0,6мк. По Граму не окрашиваются. Колонии на МПЛ и сусло-агаре масля­нистые, блестящие, бесцветные или желтоватые. На жидких подкис­ленных средах уксуснокислые бактерии образуют пленку, слабую или более плотную, опускающуюся на дно пробирок. Аэробны, но при посеве уколом в МПЖ дают гвоздевидный рост (могут быть от­несены к факультативным аэробам). Желатин не разжижают, обра­зуют каталазу и перекись водорода. Оптимальная температура раз­вития 30° С. Хорошо растут при 20° С и слабо при 37–38° С. Окисля­ют этиловый спирт в уксусную кислоту, образуя от 5 до 9,6% уксусной кислоты. Устойчивы к спирту и уксусной кислоте. Ацидофильны. В молоке в чистой культуре практически не развиваются, так как не получают доступного источника углеводов. Совместно с молочнокислыми бактериями, которые образуют молочную кислоту, развиваются очень быстро.

По данным Л. А. Мелузотюй, и др. (1958), уксуснокислые бактерии молока способны синтезировать флавин, в результате чего на поверхности свернувшегося молока при совместном развитии в нем уксуснокислых и молочнокислых бакте­рий появляется оранжевое кольцо. Это является наиболее характерными признаками, позволяющими установить присутствие уксуснокислых бактерий в продуктах, а так же наличие на поверхности жидких подкисленных сред пленки, в которой при помощи микроскопирования обнаружи­ваются подвижные бактерии.

М. Р. Гибшман (1952) установила, что эти бактерии широко распро­странены среди микрофлоры молочных продуктов. В. М. Богданов и И. Н. Пятницына (1959), работая над получением кефирной закваски на чистых культурах, пришли к выводу, что уксуснокислые бактерии должны быть непременным компонентом микрофлоры кефирной закваски, так как в результате применения закваски, не содержащей уксуснокислых бактерий, вкус кефира был нетипичным. Установлена способность уксуснокислых бактерий син­тезировать витамин B₁₂ (B.M. Богданов, 19626). А. К. Максимова и Э. Е. Грудзинская (1959) отметили, что уксуснокислые бактерии угнетают развитие дрожжей в кефире и резко снижают количество образующегося спирта.

Отмечаемые многими авторами симбиотические взаимоотношения между уксуснокислыми и молочнокислыми бактериями (В. М. Бог­данов, 1962, М. Р. Гибшман, 1952, Л. А. Банникова, 1953, и др.) заставляют рассматривать уксуснокислые бактерии не как случай­ную редкую часть микрофлоры молочных продуктов, а как постоян­ный компонент ее. В. Н. Апульциной (1965), а впоследствии Н. А. Бавиной и И. В. Рожковой (1973) были проведены сравнительные исследования по определению количества уксуснокислых бакте­рий в кефирной закваске, кефире и твороге методом посевов на пре­дельные разведения в гидролизованное молоко с рН 4,0–4,5 и обез­жиренное молоко (учет по образованию оранжевого кольца на поверхности сгустка).

Наибольшее количество уксуснокислых бактерий содержится в грибковой кефирной закваске (сотни тысяч – млн./мл), в производственной закваске и в готовом кефире содержание уксуснокислых бактерий постепенно снижается (до 100–10 тыс./мл). По-видимому, это объясняется тем, что продолжительность приготовления произ­водственной закваски и кефира недостаточна для интенсивного раз­вития уксуснокислых бактерий.

Результаты исследований творога свидетельствуют о связи меж­ду его качеством и количеством в нем уксуснокислых бактерий. Сравнительно немного уксуснокислых бактерий обнаруживалось в твороге из пастеризованного молока высшего сорта. В некоторых образцах творога первого сорта, выработанного из пастеризованного молока, и творога из сырого молока количество уксуснокислых бак­терий достигало 6 млн/г.