Нефелометричний метод визначення білків

Метод базується на вимірюванні інтенсивності світлового потоку, розсіяного твердими або колоїдними частинками, які знаходяться в розчині у підвішеному стані. За інтенсивністю розсіювання світлового потоку визначають концентрацію зразка. Розчини білків здатні до опалесценції при певних умовах в присутності хімічних реагентів (сульфосаліцилова кислота). Концентрація білка в цьому випадку визначається за ступенем опалесценції. Продукти гідролізу білків (пептони, амінокислоти та ін.) не здатні до опалесценції. Метод досить точний і швидкий, має добру кореляцію з методом К’єльдаля. Визначення оптичної густини досліджуваного розчину проводять за допомогою приладу фотоелектроколориметра (ФЕК).

При нефелометричному методі правильність результатів аналізу залежить від методу одержання суспензії, порядку змішування розчину, швидкості змішування. Тому після додавання сульфосаліцилової кислоти колбу швидко перевертають 2 – 3 рази (не більше), розчин наливають в кювету товщиною шару 5 мм і виміряють величину оптичної густини розчину при довжині хвилі 550 нм. По калібрувальному графіку за оптичною густиною визначають вміст білка. Для перерахунку вмісту білка на СР продукту необхідно визначити масову частку вологи продукту.

Біуретовий метод визначення білків

Специфічною реакцією на вміст білку є біуретова реакція, яка обумовлюється наявністю поліпептидних зв‘язків (-CO-NH-). Вона одержала свою назву від похідного сечовини – біурета, який утворює в лужному розчині мідного купоросу кольорове з’єднання. Інтенсивність забарвлення пропорційне вмісту пептидних зв’язків, а отже і концентрації білків в розчині.

Речовини з пептидними зв’язками в лужному розчині CuSO₄ утворюють забарвлені комплексні з’єднання (при цьому білки мають фіолетове, пептони і пептиди – червоно-фіолетове забарвлення. Біуретовий метод має декілька модифікацій, які відрізняються умовами екстрагування білка, способом внесення біуретового реактиву та технікою колориметрування. За допомогою приладу фотоелектроколориметра визначають оптичну густину розчину і за калібрувальним графіком визначають вміст білка в продукті (біуретовий метод в модифікації Дженнінгса). Отримані дані перераховують на сухі речовини продукту.

Визначення вмісту білка в молоці на рефрактометрі ИРФ-22

Рефрактометричний метод визначення білка в молоці базується на встановленні різниці показників заломлення досліджуваного молока і розчину, який одержаний після осадження білків розчином хлористого кальцію при кип’ятінні.

Визначення масової частки білка методом Лоурі

Метод базується на реакції реактиву Фоліна з фенольними радикалами деяких амінокислот, що входять до складу білків, в результаті чого утворюється з’єднання, що надає розчину білка синє забарвлення. Інтенсивність забарвлення залежить від вмісту білка в досліджуваному продукті. Метод має високу чутливість, що дозволяє визначати білок при концентрації його в розчині від 10 до 100мкг.

Оптичну густину визначають:

- на приладах ФЕК при довжині хвилі 580 нм, вміст білка 50-500 мкг в 1 см³;

- на спектрофотометрі при довжині хвилі 750 нм, вміст білка 10-15 мкг в 1 см³.

Для визначення вмісту білка використовують калібрувальний графік.

Метод формольного титруваня

Крім загального азоту розрізняють ще й амінний азот – це азот, що входить до вільних аміногруп (-NH₂) та інших продуктів гідролізу білка. Серед методів визначення амінного азоту вирізняють метод формольного титрування.

В молекулі амінокислоти є вільна аміногрупа, яка має лужні властивості і вільна карбоксильна група – має кислі властивості. В водному розчині лужні властивості аміногрупи нейтралізуються практично повністю кислими властивостями, тому розчин має середовище близьке до нейтрального. Було запропоновано зв’язувати аміногрупи формальдегідом:

	RCHCOOH + HCOH ® RCHCOOH ½ ½ NH2 N = CH2

(4-5)

 

 

Внаслідок цього амінна група втрачає лужні властивості, карбоксильна навпаки ще в більшій мірі проявляє свої кислотні властивості і її можна відтитрувати лугом до рН 9,1–10.

	RCHCOOH + NaOH ® RCHCOONa + H2O ½ ½ N = CH2 N = CH2

(4-6)

 

 

Приймаючи, що кількість карбоксильних груп дорівнює кількості амінних груп, зв’язаних формальдегідом, розраховують вміст амінокислот у досліджуваному розчині.

Кількість карбоксильних груп дорівнює кількості амінних груп, які зв’язані формальдегідом тільки для моноамінокарбонових груп. Повна нейтралізація карбоксильних груп проходить тільки при рН=9–9,5, при яскраво-червоному забарвленні фенолфталеїну.

Для внесення поправки на присутність дикарбонових амінокислот досліджуваний розчин попередньо нейтралізують лугом до рН=7 по індикатору бромтимоловому синьому.

Метод формольного титрування є доцільно застосовувати для прозорих або слабозабарвлених розчинів.