Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографии

Смесь аминокислот, полученных кислотным гидролизом белков, разделяют в колонке с ка-тионообменной смолой. Такая синтетическая смола содержит прочно связанные с ней отри­цательно заряженные группы (например, остат­ки сульфоновой кислоты ~S0₃~), к которым присоединены ионы Na⁺ (

В катионообменник вносят смесь аминокис­лот в кислой среде (рН 3,0), где аминокислоты в основном представляют катионы, т.е. несут по­ложительный заряд. Положительно заряженные аминокислоты присоединяются к отрицательно заряженным частицам смолы. Чем больше сум­марный заряд аминокислоты, тем прочнее её связь со смолой. Так, аминокислоты лизин, ар­гинин и гистидин наиболее прочно связывают­ся с катионообменником, а аспарагиновая и глу-таминовая кислоты — наиболее слабо.

Высвобождение аминокислот из колонки осу­ществляют вымыванием (элюированием) их буферным раствором с увеличивающейся ион­ной силой (т.е. с увеличением концентрации NaCl) и рН. При увеличении рН аминокисло­ты теряют протон, в результате уменьшается их положительный заряд, а следовательно и проч­ность связи с отрицательно заряженными час­тицами смолы.

Каждая аминокислота выходит из колонки при определённом значении рН и ионной силы. Со-бирая с нижнего конца колонки раствор (элюат) в виде небольших порций, можно получить фрак­ции, содержащие отдельные аминокислоты.

 

 

4): Азотометрические методы основаны на определении количества белкового азота, образующегося при разрушении аминокислот, входящих в состав белков.. В методе Кьельдаля, азот, содержащийся в составе белков, окисляют до иона аммония и его количество определяют титрованием точным раствором соляной кислоты. Кроме того, ион аммония может быть определен реактивом Несслера, манометрическим методом после превращения иона аммония в молекулярный азот под действием гипобромита или с помощью оптического теста Варбурга при участии фермента глутаматдегидрогеназы. Исходя из того, что белки из биологических объектов содержат в среднем 16 % азота, полученное в результате анализа количество азота умножают на коэффициент 6,25. Недостатком азотометрических методов является длительность и сложность процедуры, даже при том, что аммиак, образующийся в реакции, можно определять ферментативным методом. Автоматизация позволяет использовать этот метод в ряде случаев в качестве метода сравнения из-за его достаточной точности и воспроизводимости.

Гравиметрические методы Гравиметрические (весовые) методы определения белка основаны на высушивании белков до постоянной массы и взвешивании на аналитических весах. Методы трудоемки и в настоящее время практически не используются для определения общего белка сыворотки. Гравиметрический метод продолжает использоваться в некоторых лабораториях для определения фибриногена в плазме крови.

«Преципитационные» методы определения общего белка основаны на снижении растворимости белков и образовании суспензии взвешенных частиц под воздействием различных агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Результаты данной группы методов зависят от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения рН среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению воспроизводимых результатов. «Преципитационные» методы для определения белка в сыворотке крови не получили признания и нашли применение при определении белка в моче, спинномозговой жидкости и многих индивидуальных белков с использованием специфических антител.

Спектрофотометрические методы определения общего белка сыворотки крови основаны на измерении светопоглощения в ультрафиолетовой области.

Растворы белка обладают поглощением при 270–290 и 200–225 нм. Поглощение при 270–290 нм определяется присутствием в молекуле белка ароматических аминокислот — тирозина, триптофана и фенилаланина. Поглощение при 200–225 нм практически в 20 раз выше, чем при 280 нм, и обусловлено главным образом пептидными связями.

Точность и специфичность методов определения белка, основанных на поглощении при 270 –290 нм, невелика, поскольку содержание тирозина и триптофана может колебаться в различных белках сыворотки крови. Кроме того, присутствие в сыворотке свободных аминокислот — тирозина и триптофана, мочевой кислоты и билирубина, поглощающих при 280 нм, вносит определенную погрешность. В связи с этим данный метод не используют для прямого определения содержания общего белка в сыворотке.

Напротив, поглощение в ультрафиолетовой области — 200 – 225 нм обусловлено в основном пептидными связями, в связи с чем величина поглощения различных белков сыворотки различается незначительно. В этом спектральном диапазоне закон Бера соблюдается при концентрации белка в сыворотке до 120 г/л.

Определение общего белка сыворотки крови с помощью прямой фотометрии при 210 нм обеспечивает получение результатов, сравнимых с биуретовым методом и методом Кьельдаля. В то же время данный метод практически не применяется из-за необходимости использования кювет, не поглощающих при 210 нм, и монохроматора, что удорожает метод.

Рефрактометрические методы определения общего белка сыворотки основаны на способности растворов белка к преломлению светового потока. показатель преломления воды равен 1,3332,. Калибровку прибора проводят сывороткой с известной концентрацией белка. Простота делает рефрактометрию удобным методом для определения содержания общего белка в сыворотке крови, хотя при ряде заболеваний, в частности, при сахарном диабете, хронической почечной недостаточности его использование может приводить к существенной ошибке.

Колориметрические методы определения общего белка основаны на цветных реакциях белков с хромоген-образующими реактивами или на неспецифическом связывании красителя.

Среди колориметрических методов определения концентрации общего белка сыворотки наиболее распространенным считается биуретовый метод, основанный на так называемой «цветной биуретовой реакции», в ходе которой белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет, интенсивность окраски зависит от концентрации общего белка в сыворотке. Биуретовый метод определения общего белка в сыворотке крови был утвержден в качестве унифицированного

Колориметрические методы определения общего белка сыворотки крови достаточно просты и относительно дешевы. К недостатку метода относится интерферирующее действие некоторых веществ (в том числе лекарств).

 

 

5) По форме молекул белки можно разделить на две большие группы — глобулярные (имеющие сфериче­скую форму) и фибриллярные (удлиненной формы).

К глобулярным относят бел­ки, у котор.молекула имеет форму эллипса.их Большинство и. Они имеют компактную структуру и многие из них, за счёт удаления гидрофобных радикалов внутрь молекулы, хорошо растворимы в воде. Нагляд­ные примеры строения и функционирования глобулярных белков — рассмотренные выше миоглобин и гемоглобины.

Фибриллярные белки имеют вытянутую, ни­тевидную структуру, К фибриллярным белкам относят кол­лагены, эластин, кератин, выполняющие в орга­низме человека структурную функцию, а также миозин, участвующий в мышечном сокращении, и фибрин — белок свёртывающей системы кро­ви.