Спектрофотометрия в УФ-области спектра

Спектрофотометрия – метод анализа, основанный на измерении спектров поглощения в оптической области электромагнитного излучения, обусловленного электронными переходами: s-s^*, n-s^*, p-p^*, n-p^*.

Различные электронные переходы в молекулах веществ требуют неодинаковой энергии, а поэтому полосы поглощения располагаются при разных длинах волн.

Использование УФ-спектрофотометрии в химико-токсикологическом анализе осложняется присутствием в извлечении примесей эндогенных соединений, что особенно проявляется при анализе трупного материала, подвергшегося гнилостным изменениям. Эндогенные соединения создают так называемое «фоновое поглощение», искажают характер спектра поглощения исследуемого соединения.

Для устранения влияния фонового поглощения в различных методиках используют индивидуальные способы очистки, как на первом этапе изолирования (при настаивании объекта с полярными растворителями), так и на втором этапе (после экстракции токсических веществ органическим растворителем из водной фазы). Если фоновое поглощение остается достаточно высоким, то по характеру спектра не всегда удается идентифицировать вещество.

 

Хроматомасс-спектрометрия

 

Масс-спектрометрия, масс-спектральный анализ – метод анализа веществ путем определения масс (чаще отношения масс к заряду m/z) и относительного количества ионов, получаемых при ионизации исследуемых веществ или уже присутствующих в изучаемой смеси. Совокупность значений m/z и относительных величин токов этих ионов представляет собой график, который называют масс-спектром вещества.

С помощью масс-спектрометрии можно измерить точную молекулярную массу органического соединения, рассчитать элементный состав, установить химическое и пространственное строение, изотопный состав, провести качественный и количественный анализ сложной смеси.

В настоящее время используется сочетание хроматографического и масс-спектрометрического методов. Этот метод получил название хроматомасс-спектрометрии.

Хроматомасс-спектрометры выпускаются в двух вариантах – в комбинации с газовым или газожидкостным хроматографом (соответственно ГХ или ГЖХ) для анализа веществ, находящихся в газовой фазе или в комбинации с высокоэффективным жидкостным хроматографом для анализа труднолетучих, полярных и термолабильных веществ.

Если в лаборатории имеется только комплект ГХ – масс-спектрометр, то при анализе малолетучих (барбитураты и др.), полярных соединений и их метаболитов (опиаты и др.) для использования метода необходима дериватизация исследуемых веществ. Дериватизация позволяет исключить потери веществ из-за низкой летучести или сильной полярности. При анализе полярных соединений за счет дериватизации вещества превращаются в менее полярные и более летучие.

Хроматомасс-спектрометр представляет собой сложный прибор, включающий ионооптическую, высоковакуумную системы, электронную аппаратуру для усиления и измерения ионных токов, а также хроматографический узел для разделения смеси.

Исследуемую пробу вводят в хроматограф, где происходит разделение смеси веществ.

Поток разделенных веществ с газом-носителем проходит через специальный сепаратор, который отделяет газ-носитель от вещества. Затем исследуемое соединение попадает в ионизационную камеру масс-спектрометра. В этой камере частицы веществ ионизируются и поступают в масс-анализатор, где они делятся по массам. Относительные значение сил токов, возникающих за счет ионов с разной массой, измеряются системой регистрации. Масс-спектр смеси веществ представляет собой ряд последовательно расположенных пиков веществ. Деление веществ по массам в анализаторе осуществляется под действием магнитного поля (чаще однородного). При прохождении пучка ионов через магнитное поле ионный пучок фокусируется на щель приемника. В процессе фокусировки пучок ионов с массой m отделяется от ионов с массой m+Dm. Этот процесс происходит в плоскости щели приемника на расстояние, которое определяется величиной дисперсии (или разделяющей способности) прибора.

Таким образом, разрешающая сила хроматомасс-спектрометра – это мера его способности разделять два иона с определенной разницей масс.

Детектор (регистрирующее устройство) в приборе осуществляет регистрацию электрических сигналов в определенной последовательности. Непрерывная запись полного ионного тока в течение всего времени хроматографического разделения представляет собой хроматограмму смеси. В момент появления максимумов на хроматограмме масс-спектрометр быстро записывает полный масс-спектр каждого компонента с интервалом в 1-2 с. Масс-спектр является качественной характеристикой разделяемой смеси и позволяет идентифицировать ее компоненты (предел обнаружения веществ 10^-12 г/мл).

Идентификация веществ, выделенных из биологического объекта, проводится по времени удерживания и соответствующему каждому пику на хроматограмме масс-спектру с определенной величиной отношения массы иона к его заряду.

Хроматомасс-спектрометрия является универсальным методом, позволяющим работать с весьма сложными смесями, содержащими всего 10^-10-10^-14 г/мл определяемого компонента, что в миллиарды раз меньше требуемых количеств вещества для обычных масс-спектрометров. Это особенно ценно для определения следовых количеств ядовитых веществ в биологических жидкостях, волосах и в трупном материале.