Очистка вытяжек из биологического материала на первом этапе изолирования

В нейтральной среде белки мало растворимы в воде и спирте. Однако при подкислении они в большей степени растворяются в воде. Значительно сильнее в подкисленной воде способны растворяться пептиды и аминокислоты. При анализе биологического материала, находящегося в состоянии гнилостного разложения, количество извлекаемых эндогенных соединений увеличивается.

По составу примесей водная и спиртовая вытяжки отличаются между собой. В водном извлечении содержится больше низкомолекулярных пептидов и аминокислот. В спиртовой вытяжке содержатся примеси липопротеидов, липидов, птомаинов, некоторых аминокислот. Белки в спиртовое извлечение переходят в меньшем количестве, чем в водное, так как спирт вызывает денатурацию белка и уменьшает его растворимость.

Очистка вытяжек от балластных веществ достигается несколькими способами: осаждением примесей различными реагентами, фильтрованием, центрифугированием, гель-хроматографией и другими методами.

Осаждение белковых молекул методом высаливания проводится путем добавления к водной вытяжке из объекта электролитов. В результате изменяется ионная сила раствора.

При изменении ионной силы от 0 до 0,05-0,1 растворимость многих веществ может увеличиваться. При высоких концентрациях электролитов в растворе, особенно при добавлении их до его насыщения, белки выпадают в осадок за счет резкого снижения их растворимости. Поэтому для высаливания белков используют высокие концентрации солей.

В качестве электролитов при очистке извлечений из трупного материала применяют соли одновалентных катионов: сульфат аммония, вольфрамат натрия и др.

Метод высаливания является одним из эффективных способов осаждения примесей из вытяжек, полученных при настаивании гнилостно-разложившегося биологического материала с подкисленной водой.

Осаждение белковых молекул кислотами, спиртом и нагреванием. Осаждение белков из вытяжек можно проводить с помощью трихлоруксусной, вольфрамовой, фосфорно-вольфрамовой и фосфорномолибденовой кислот.

Белковые вещества могут осаждаться после их денатурации путем нагревания или при добавлении этилового спирта.

Осаждение примесей указанными методами может привести к потере исследуемых соединений, так как не исключено соосаждение ядовитых веществ и их адсорбции на поверхности образующихся осадков белковых молекул. Кроме того, ядовитые вещества, в молекуле которых имеются эфирные группы, при нагревании могут быть разрушены.

Фильтрование и центрифугирование. Эти способы позволяют отделить вытяжки от механических загрязнений и от образования продуктов осаждения. Фильтрование - процесс более длительный, и кроме того, материал фильтров часто адсорбирует ядовитые вещества.

Центрифугирование является эффективным способом отделения примесей и осажденных белков от основного раствора. Современные центрифуги позволяют достигать до 15 тысяч оборотов в минуту и получать сравнительно чистую надосадочную жидкость.

Гель-хроматография используется для очистки водной вытяжки из биологических объектов от примесей балластных веществ. Этот метод основан на различной способности молекул проникать в поры неионогенного геля, который служит неподвижной фазой. Для гель-хроматографии в токсикологической химии используют гидрофильные полимерные сорбенты, в частности сефадексы.

При работе гель помещают в колонку диаметром 2,5 см и высотой 43-45 см. Водную вытяжку из объекта пропускают через колонку. Крупные молекулы белков и пептидов не проникают или проникают только в часть пор. Когда колонку промывают элюентом, первыми вымываются наиболее крупные молекулы, последними – низкомолекулярные вещества.

Экстракция примесей из вытяжек на первом этапе применяется очень редко. Это связано с тем, что трудно подобрать условия, при которых возможно отделить большие количества примесей от исследуемых веществ, содержащихся часто в объекте в малых концентрациях.