Колоночная жидкостная хроматография

В колоночной жидкостной хроматографии сорбент находится в стеклянной или металлической трубке (колонке).

В классическом варианте колоночной хроматографии используются сорбенты с диаметром частиц более 100 мкм. Колонка может иметь длину до нескольких метров. Элюент продвигается по колонке под действием силы тяжести.

В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) используются сорбенты, обладающие особыми свойствами (однородность частиц, ненабухаемость и т.д.). Диаметр частиц этих сорбентов не превышает 50 мкм. Часто в ВЭЖХ применяют сорбенты с различными привитыми группами (см. рис. 24.1). Скорость движения подвижной фазы и эффективность разделения в ВЭЖХ значительно выше, чем в классическом варианте хроматографии.

24.3.1. Устройство жидкостного хроматографа

Основные узлы жидкостного хроматографа показаны на рис. 24.5.

Рис. 24.5. Принципиальная схема жидкостного хроматографа

Подвижная фаза подаётся в колонку с помощью насоса. Блок подачи элюента может включать в себя также систему дегазации, устройство для градиентного элюирования, измерители давления. До попадания в насос подвижная фаза должна быть профильтрована и освобождена от растворённых в ней газов (“дегазирована”), так как пузырьки газа при попадании в колонку приводят к снижению её эффективности, а при попадании в детектор вызывают беспорядочные колебания нулевой линии.

Ввод пробы в жидкостный хроматограф может проводиться с помощью петлевого дозатора, микрошприца (роль шприца может выполнять сам насос) и др.

Хроматографические колонки в ВЭЖХ, в отличие от газохроматографических колонок, прямые. Они имеют длину 10 - 30 см и внутренний диаметр 4 - 6 мм, а в микроколоночных хроматографах, соответственно, 5 - 7 см и 1-2 мм. Корпус колонки представляет собой цилиндрическую трубку, изготовленную из стекла, нержавеющей стали или полимерного материала. На верхнем и нижнем концах колонки расположены фильтры, представляющие собой диски из пористой нержавеющей стали. Назначение фильтров – удерживание сорбента в колонке и задержка механических примесей, которые могут находиться в подвижной фазе.

В табл. 24.3 перечислены детекторы, наиболее часто используемые в ВЭЖХ.

Табл. 24.3

Характеристика некоторых детекторов, используемых в

жидкостных хроматографах

Детектор	Измеряемый сигнал	Определяемые вещества
дифференциальный рефрактометр	разность показателей преломления элюата и элюента	универсальный
УФ-детектор с фиксированной длиной волны (254 нм)	разность между поглощением элюата и элюента при 254 нм	вещества, поглощающие электромагнитное излучение с длиной волны 254 нм
спектрофотометрический	разность между поглощением элюата и элюента при выбранной длине волны	вещества, поглощающие излучение с выбранной длиной волны
флуоресцентный	интенсивность испускаемого света	вещества, обладающие флуоресценцией
кондуктометрический	низкочастотная электропроводность элюата	ионы
потенциометрический	разность потенциалов ионо-селективного электрода и электрода сравнения	ионы
вольтамперометрический	сила тока при постоянном потенциале электродов	вещества, способные к электрохимическому окислению или восстановлению

Практическое применение

Высокоэффективная жидкостная хроматография используется для разделения, в том числе и препаративного выделения, обнаружения и идентификации, а также количественного определения веществ различной химической природы (как полярных, так и неполярных, как ионов, так и молекул, как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных).

В фармацевтическом анализе метод ВЭЖХ используется чаще, чем метод газовой хроматографии, поскольку многие лекарственные вещества представляют собой сложные органические соединения, имеющие высокие температуры кипения или разрушающиеся при нагревании. Основные области применения ВЭЖХ в фармацевтическом анализе:

· идентификация лекарственных веществ, присутствующих в лекарственных формах;

· определение примесей в лекарственных веществах (как в индивидуальных образцах, так и в лекарственных формах);

· количественное определение лекарственных веществ, входящих в состав лекарственных форм (особенно в случае лекарственных форм сложного состава или при малом содержании определяемого компонента);

· определение лекарственных веществ в биологических объектах.