Завдання № 1 . Техніка мікроскопування

1. Знімають з мікроскопа чохол і помішують перед джерелом світла на відстані З - 5 см від краю стола.

2. Повністю відкривають важільцем ірис - діафрагму і піднімають конденсор у верхній граничний стан за допомогою непарного макрогвинта.

 

3. Регулюють освітлення. Для цього виставляють за допомогою револьверного механізму об'єктив 8х і встановлюють його парними макрогвинтом на відстані 15 - 10 мм від предметного столика. Дивлячись в окуляр, обертають дзеркало. При цьому намагаються забезпечити максимальне і рівномірне освітлення поля зору.

4. Поміщають на предметний столик препарат - крохмаль. Револьверним механізмом встановлюють необхідний об'єктив. Якщо користуються імерсійним (90х), то на предметне скло наносять краплю апертурної рідини. Мікроскопування забарвлених фіксованих препаратів — мазків здійснюють за допомогою імерсійної системи.

5. Дивлячись в окуляр, опускають за допомогою макрометричного гвинта об'єктив. Якщо робота йде у імерсійній системі, то об'єктив опускають до занурення з олію.

6. Наведення на різкість (фокусування). Дивлячись в окуляр, обертають макровинт «на себе» до появлення не чітких контурів зображення. Після цього обертають мікрогвинт і здійснюють остаточну наводку на різкість.

7. Розглядають та вивчають препарат

8. Після закінчення роботи піднімають тубус мікроскопа, обережно протирають об'єктив 90х фільтрувальним папером з метою усунення залишків олії. Обертають револьверним механізм і встановлюють його на заглушку. Обертають макрогвинт і опускають об'єктиви в крайнє положення. Зачохлюють мікроскоп.

 

Завдання № 2

На предметно скло наносять зразок крохмалю, розтирають його у вигляді кола діаметром 15-20 мм. Шар крохмалю повинен бути дуже тонким. Мікроскопують при збільшенні у 120 та 600 разів.

Практично вивчають зразки крохмалю, роблять висновки про їх розмір, будову, зовнішній вигляд. Роблять зарисовки у протокол.

 

Контрольні питання:

1. Що таке вирішальна здатність мікроскопа?

2. Яке збільшення забезпечує світловий мікроскоп?

3. Які найменші розміри "об'єкта дозволяє побачити мікроскоп?

4. Як працювати з сухоповітряними об'єктивами і як із імерсійними?

 

Використана література:

1. Слюсаренко Т.П. Лабораторний практикум з мікробіології харчових виробництв. -М.: Легке та харчове виробництво, 1984.

2. Бранцевич Л.Г., Лисенко Л.Н., Овод В.В., Гурбін A.B. Мікробіологія: практикум. - К.: Вища школа, 1987.

 

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 2

Тема: Морфологія бактерій, приготування препаратів для вивчення морфології мікроорганізмів та їх забарвлення по Граму.

Мета заняття. Вивчити основні форми бактерій, їх розміри, та інші морфологічні ознаки. Навчитися практично відрізняти основні форми бактерій під мікроскопіювакня. Засвоїти методику приготування фіксованого препарату – мазка, познайомитись з техникою приготування препарату «роздавлена» крапля. Засвоїти методику забарвлення за Грамом.

Обладнання та матеріали. Біологічний мікроскоп, імерсійна олія, плакати з зображенням основних форм бактерій, фільтрувальний папір, набір барвників, предметне та накривне скло, стерильна вода, спиртівки, мікробіологічні петлі, суспензія ґрунту.

Методичні вказівки.

Більшість видів бактерій мають відносно стабільну морфологію, яка притаманна певному виду і набута з процесі еволюції. Але інколи зустрічаються таке явище, поліморфізм. При цьому спостерігається зміна форм клітин під впливом різких факторів (поживне середовище, вік, стадія розвитку та ін.).

За зовнішнім виглядом відрізняють три основні форми бактерій:

1. кулясті (коки, циліндричні);

2. звивисті;

3. паличкоподібні (паличкові)

I. Характеристика кулястих бактерій

Коки (від лат. Соссus – ягода), як правило, мають сферичну форму. Зустрічаються деформовані клітини, які можуть мати еліптичну, бобоподібну, загострену, витягнуту форми. Діаметр клітини становить, в середньому, від 0,5 до 1 мкм.

В залежності від взаємного розташування клітин, характеру поділу і біологічних властивостей коки підрозділяють на 6 родів (мал.1)

 

 

 

Tertacoccus Sarcina Staphilococcus

 

 

Мал. 1. Кулясті форми бактерій.

 

.

p. Bacterium p. Bacillus p. Clostridium

 

Мал. 4. Класифікація паличкоподібних форм в залежності від здатності до спороутворення.

 

p. Bacterium - це паличкоподібні бактерії, що, як правило, не утворюють спор. Типовим представником є кишкова паличка {Escherichia colі), яка завжди міститься в кишечнику людини та тварин. Прикладом неспоротворних бактерій є така ж - Pseudomonas fluorescens - дрібні палички, що мешкають у воді, ґрунтах та ін. Трав'яна паличка Рseudomonиs herbicola - завжди міститься на свіжозібраному зерні. Серед неспоротворних є збудники псування харчових продуктів. Прикладом є Serraria marcescens («чудова паличка»), яка викликає, процес гниття м'ясних продуктів та утворює червоний пігмент. Salmonella typhi та Salmonella paratyphi викликають у людини черевнотифозні захворювання. Інші представники р. Salmonella при попаданні з шлунково - кишковий тракт з продуктами харчування (м'ясо, яйця, молоко та ін.) викликають харчові токсикоінфекції.

Представники p. Shigella є збудниками дизентерії, яка передається харчовим шляхом (брудна вода, немиті фрукти, овочі та ін.).

p. Bacillus - це споротворні паличкоподібні бактерії. Діаметр спор не перевищує у них поперечного розтину палички і тому спороутворення у бацил не приводить до змін форми клітини(див. мал. 4). За типом дихання бацили, як правило, відкосяться до аеробів (потребують кисень для свого розвитку). Прикладом сапрофітних форм бацил є В. subtilis («сінна» паличка), В. Licheniformis («картопляна» паличка), які мешкають у ґрунті і викликають процеси гниття. Серед бацил є патогенні представники, наприклад В. anthracis – збудник сибірської виазки.

p. Clostridium - це споротворні паличкоподібні бактерії, у яких спора за своїм розміром перевищує поперечний розтин палички. При цьому змінюється зовнішня форма палички і зона може нагадувати веретено або ракету. Clostridium (лат.closizr веретено) за типом дихання відноситься, як правило, до облігатних анаеробів.

Прикладом є маслянокислі бактерії (Clostridium botyricum), які викликають маслянокисле бродіння з утворенням масляної т оцтової кислот. У харчовій промисловості дуже небезпечним представником є Clostridium botulinum - збудник харчового отруєння (ботулізм). Е також і патогенні форми клостридій – CI. Perfringепs (збудник газової генгрени), Сl. tetani - (збудник стовбняка).

 

1. ВІБРІОНИ. Клітини мають один завиток (вигляд коми) і товсте тільце. Типовим представником є холерний вібріон - збудник холери, а також водні вібріони, що мешкають у прісних водоймищах.

2. СПІРИЛИ. Клітини мають від 4 до 6 завитків спіралі і товсте тільце.

3. СПІРОХЕТИ. Клітини мають від 6 до 15 і більше завитків спіралі та тонке тільце. Довжина спірохет може бути дуже великою (300 - 500 мкм).

Типовим представником є збудник венеричного захворювання - сифілісу (Treponema)

Звивисті бактерії відіграють велике значення в кругообігу речовин у природі, деякі види становлять значний інтерес для медичної мікробіології, але у харчовій мікробіології ці форми бактерій не відіграють суттєвої ролі, тому що не беруть участі у псуванні харчових продуктів і не викликають харчових отруєнь.

III. Характеристика паличкоподібних бактерій.

Паличкова форма бактерій є самою чисельною і різноманітною групою бактерій.

Клітинна стінка паличкоподібних бактерій являє собою тверду нееластичну трубку. Тому вони ростуть переважно в довжину, а коливання товщини відносно невеликі переважно в межах 0,5 - 1 мкм).

По довжині паличкові поділяють на дрібні (до 1 мкм), середні (2-4 мкм), великі більш ніж 4 мкм).

По товщині паличкові бактерії поділяють на тонкі (до 1 мкм) і товсті (> і мкм). Форма кінців у паличкових буває закруглена, загострена, обрубана.

 

Мал. 3. Класифікація паличкоподібних форм бактерій за формою кінців.

 

Слід зазначити що переважна більшість паличок мають закруглену форму кінців. По здатності до спороутворення паличкоподібні форми бактерій підрозділяються на три роди: p. Bacterium (бактерії), p. Bacillus (бацили), p. Clostridium (клостридії). (мал.4)

 

1. МІКРОКОКИ (назва від лат. micros - малий) - Micrococcus. КЛІТИНИ розташовані поодиноко, хаотично. Ділення клітин відбувається з різних площинах. Мікроскопи сапрофітами, мешкають у повітрі і воді.

2. ДИПЛОКОКИ (лат. diplos - подвійний) - Diplococcus. Клітини розташовані попарно, ділення відбувається в одній площині.

Ця група коків містить багато патогенних видів. Зокрема пневмокок - збудик пневмонії, менінгокок - збудник менінгіту, гонокок - збудник гонореї (мають бобоподібну форму).

3. СТРЕПТОКОКИ (лат. streptos - ланцюжок) - Streptococcus. Клітини утворюють ланцюжки різної форми, ділення відбувається в одній площині. Деякі види стрептококів викликають різні захворювання (запалення верхніх дихальних шляхів, сепсис та негативні процеси).

4. ТЕТРАКОКИ (лат. terra - чотири) - Tertacoccus. Клітини розміщуються по чотири і діляться в двох взаємно перпендикулярних площинах. Надзвичайно рідко зустрічаються як збудники хвороб у людини.

5. САРЦИНИ (лат. sarcio - з'єдную) - Sarcina. Клітини утворюють пакети або тюки по 8, 16, 32 шт. вони часто зустрічаються у повітрі. Хвороботворних видів серед сарцин не встановлено.

Серед сарцин зустрічаються рухомі та споротворні види. (наприклад, Sarcina urea, Sarcina luteа)

 

6. СТАФІЛОКОКИ (лат. staphyie - гроно) - Staphylococcus. Клітини утворюють скупчення, які нагадують виноградне гроно. Ділення відбувається хаотично, у різних площинах. Деякі види стафілококів здатні викликати захворювання у людини та тварин (гнійно запальні захворювання). Небезпечним видом у харчовій промисловості є золотий стафілокок {Staphylococcus аигеиз), який викликає харчові отруєння. Найшвидше токсиноутворення відбувається у молоці, заварному кремі, м'ясних фаршах, рибних консервах та ін.

II. Характеристика звивистих форм бактерій.

Звивисті бактерії, як правило, грамнегативні, рухомі. Більшість звивистих належить до сапрофітів, мешкають у водоймищах з застійною водою та здійснюють розклад органічних речовин відмерлих рослинних та тваринних організмів. Але зустрічаються і патогенні форми - збудники інфекційних хвороб.

Звивисті форми відрізняються між собою кількістю завидків та товщиною тільця. В залежності від цього відрізняють (мал. 2)

 

Vibro (вібріони)

Мал. 2. Звивисті форми бактерій.

За взаємним розташуванням паличкові розподіляються на три підгрупи: (мал.№5)

 

Мал. 5. Форми взаємного розташування клітин паличкоподібних бактерій.

 

 

а) поодинокі палички. Розмішуються хаотично (без певної системи). Така форма

взаємного розташування клітин характерна для переважної більшості паличкових.

б) диплобактерії та диплобаціли. Клітини бактерій або бацил розташовано попарно: (2 шт.).

в) Стрептобактерїі та стрептобацили. Клітини бактерій або бацил утворюю

ланцюжки різної довжини (див. мал. 5).

 

 

Хід роботи.

 

Завдання № 1. Вивчення морфологічних ознак бактерій.

Взяти суспензію ґрунту, зробити препарат «роздавлена крапля», розглянути морфологічні ознаки різних виліз бактерій, зробити зарисовки з протокол. На предметне скло нанести суспензію ґрунту розтерти її у вигляді кола діаметром 15 – 2 мм; зверху накрити накривним склом, щоб не було бульбашок повітря.

 

Завдання № 2. Приготування препаратів мазків.

Для приготування препаратів мазків використовують предметне та накривне скло. Скло повинно бути абсолютно чистим, прозорим і добре знежиреним. У противному випадку можна прожарити скло у полум'ї спиртівки, нанести на скло краплю спирту, а потім змити водою.

Техніка приготування фіксованого препарату мазка включає декілька етапів:

1. Приготування мазка. На предметне скло петлею наносять краплю суспензії ґрунту.

2. Висушування мазка. Проводиться звичайно при кімнатній температурі на повітрі. Але для прискорення висушування можна підігріти мазок, тримаючи його високо над полум'ям спиртівки.

3. Фіксація препарату - мазка. Проводиться для того, щоб:

а) вбити мікроорганізми і зробити їх безпечними;

в) закріпити клітини на склі, щоб вони не змивалися при забарвленні;

г) зробити мікробну клітину доступною забарвленню (вбиті клітини - забарвлюються краще ніж живі). Фіксація буває фізичкою та хімічною. Фізична фіксація зводиться до теплової обробки. Для цього скло з мазком три рази проносять у полум'ї спиртівки. Загальний час фіксації становить 5-6 секунд.

 

Завдання №3. Забарвлення за Грамом.

 

Метод був запропонований датським вченим Грамом ще в 1884 р. і набув значного поширення у мікробіологічній практиці, тому що має діагностичне значення при вивченні мікроорганізмів.

В залежності від результатів забарвлення за Грамом усі мікроорганізми поділяються на дві великі групи:

- Грампозитивні (Гр-) - забарвлюються у фіолетовий колір.

- Грамнегативні (Гр-) - забарвлюються у червоний колір.

Різне відношення мікроорганізмів до забарвлення за Грамом обумовлене відмінностями у хімічному складі та будові клітинної стінки.

1. На фіксований мазок кладуть шматочок фільтрувального паперу і наносять декілька краплин генціанвіолету, витримують 1 - 2 хвилини. Папір знімають. Барвник зливають (водою не змивають!).

2. На мазок наносять розчин Люголя (суміш КІ та I2). Витримують 1 - 2 хвилини. Барвник зливають (водою не змивають!).

3. Наливають на мазок спирт (96°/о-ний). Знебарвлення проводять протягом 30 - 40 секунд. Препарат ретельно промивають водою.

4. Наносять фуксин і витримають 1 -2 хвилини. Барвник зливають. Препарат промивають водою і висушують за допомогою фільтрувального паперу. Наносять імерсійну олію і вивчають під мікроскопом (об'єктив 90х), опустивши об'єктив у олію.

5. Мікроскопують фіксовані забарвленні препарати в імерсійній системі при повністю відкритій ірис - діафрагмі та максимально піднятому конденсорі Аббе.

До грампозптивних мікроорганізмів відносять: коки, споротворні паличкові бактерії (р. Bacillus, р. Clostridum), неспоротворні молочнокислі паличкові бактерії.

До гоамнегативних мікроорганізмів відносяться: неспоротворкі паличкові (р. Bacterium) та звивисті бактерії.

Виконують зарисовки у протокол та роблять висновки.

 

Контрольні питання:

1. Які існують три основних форми бактерій?

2. Що таке спороутворення у бактерій?

3. Як розташовані спори по довжині палички?

4. Які існують форми розташування джгутиків у бактерій?

5. Яка мета фіксації?

6. Які барвники використовуються при забарвленні за Грамом?

 

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА №3.

 

Тема: Вивчення морфологічних ознак міцеліальних грибів, дріжджів.

Ціль: Вивчити техніку готування препаратів для вивчення живих мікроорганізмів, морфологічні ознаки дріжджів міцеліальних грибів.

Матеріали й устаткування: мікроскоп, предметні і покрівні скельця препарати дріжджів і міцеліальних грибів (мукор, аспергіллус, пеніциліум).

План роботи.

1. Вивчити морфологічні ознаки дріжджів і міцеліальних грибів за допомогою препарату "роздавлена крапля".

2. Вивчити зовнішній вигляд, колір міцеліальних грибів.

3. Вивчити способи розмноження міцеліальних грибів.

 

Міцеліальні гриби – це велика група нижчих рослинних організмі позбавлених хлорофілу. Вони розвиваються на поверхні субстратів, утворюючи видимі простим оком колонії.

Тіло гриба називається грибницею, чи міцелієм. Воно складається з гонки сильно розгалужених ниток - гіфів. Від міцелію піднімаються повітряні гіфи. Гіф ростуть вершинами чи кінцями відростків.

Характерною рисою грибів є велика розмаїтість способів розмноженя: безстатеве (вегетативне) і полове. Безстатеве розмноження здійснюється різним шляхами. Грибниця може вирости з будь-якого уривка, міцелію. Повітряні гіф міцелію можуть розсипатися на окремі клітки (оідії), що згодом проростають утворюють новий міцелій. Дуже розповсюдженим способом безстатевого розмноження у грибів є спороутворюзання.

Мукорова цвіль. Гриби мають міцелій, що складається з однієї сильно розгалуженої клітки, від якої відходить плодоносний гіф – спорангієносець, на якому розташовується спорангій із перепонками. Мукорові гіфи викликають спиртове бродіння (окислювання), тому вони використовуються в промисловості для виробництва різних органічних кислот, спирту, ферментних препараті.

Колір гриба сіро-чорний.

Аспергілова цвіль. Міцелій гриба септированний. Розмноження конідіями, що утворюються на конідієносцях. Деякі види, наприклад Аспергіллус нігер, застосовуються в промисловості для одержання лимонної кислоти. Аспергіллус оризія служить для одержання ферментів амілази, пентинази.

Колір гриба від жовтого до оранжево-червоного.

Пеніциліум. Міцеліальні гриби мають септированний міцелій. Від міцелия відходять конілієносці, що нагадують кисть руки. До роду пеніцилліум відноситься велика кількість видів, що приймають участь у дозріванні сирів і отримали назву «шляхетних цвілей». Окремі види використовують для виробництва пеніцилліну.

 

 

Колір гриба зелений.

Молочна цвіль. Міцелій білий септирований. Оідії відокремлюються безпосередньо від кінця міцелію. Росте при доступі кисню в кислому середовищі. Колір білий.

 

ХІД РОБОТИ.

Завдання 1.

Приготувати препарат дріжджів у виді "роздавлена" крапля. Для цього на середину предметного скла нанести краплю суспензії дріжджів. Обережно накрити і роздавити покрівним склом. Залишки вологи зняти фільтрувальним папером. Отриманий препарат розглянути під мікроскопом при слабкому висвітленні зі збільшенням у 120 і 600 разів. Розглянути 2-3 поля зору мікроскопа і замалювати, відзначаючи характерні ознаки дріжджів (зовнішній вигляд кліток, їхні розміри, клітки що брунькуються). Розглянути форму і будівлю клітки, здатність до руху дріжджів.

Завдання 2.

Приготувати препарат міцеліальних грибів. Для цього на знежирене скло нанести краплю етилового спирту. У цю краплю бактеріологічною петлею внести шматочок міцелію гриба і за допомогою голки обережно розправити гіфи міцелію й органи розмноження. Краплю накрити покрівним склом і злегка придавити. Мікроскопіювати при збільшенні в 120 разів. Розглянути будову грибниці й органів розмноження, наявність септи.

Зробити препарати 2-3 видів цвілі, порівняти їхні морфологічні ознаки і зробити висновок до якого виду міцеліальних грибів вони відносяться.

Завдання 3.

З предметного скла зняти міцелій гриба, знову накрити його покрівним склом і розглянути при збільшенні в 600 разів. Зробити висновок про спосіб розмноження гриба, розглянувши його органи розмноження. По кольору цвілі визначити, до якого виду зона відноситься. Зробити замальовки й оформити протокол роботи.

 

Контрольні питання:

1. Чим відрізняється бактеріальна клітка від дріжджівої?

2. Як розмножуються дріжджі і міцеліальні гриби?

3. Які умови необхідні для розмноження міцеліальних грибів?

4. Яка будівля тіла і спосіб розмноження грибів: мукор, аспергіллус, пеніцилліум.

Використана література:

1. А.Ю. Жвирблянська, O.A. Бакушинська. Мікробіологія в харчовій промисловості. -М.: Харчова промисловість, 1975р., с. 44-51

2. А.Я. Панкратов, B.C. Григоров, Р.Л. Кащенко Керівництво до лабораторних занять по мікробіології, - М.: Харчова промисловість, І975р.. стор. 50-60.

 

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА №4.

 

Тема: Вивчення техніки посіву і пересіву мікроорганізмів на живильні середовища.

Ціль: Навчитись техніки посіву і пересіву мікроорганізмів в рідкі і тверді живильні середовища поверхневим і глибинним методом.

Матеріали й устаткування: живильні тверді і рідкі середовища, культура мікроорганізмів, чашки Петрі, пробірки з пробками, бактеріологічні петлі, спиртівка, шпатель, електроплитка.

 

План роботи.

Посів і пересів мікроорганізмів у рідке середовище.

Посів мікроорганізмів на тверде живильне середовище поверхневим способом..

Посів мікроорганізмів на тверде живильне середовище глибинним способом.

 

Для виділення мікроорганізмів з виробничих і природних субстратів, підтримати в активному стані чистих культур, готування робочих культур з метою передач виробництво, у лабораторній практиці користаються методами посіву і пересіву.

Посівом називається внесення частини досліджуваного матеріалу в стерильно-живильне середовище, п ересівом - перенесення частини вирощеної на живильної середовищі культури мікроорганізмів на інше свіже стерильне середовище. Посів рідке середовище роблять петлею чи піпеткою. Посів на тверді живильні середовища роблять петлею або шпателем Дригальского.

 

Хід роботи

Завдання 1.