Характеристика аденовируса крупного рогатого скота. Лабораторная диагностика и средства специфической профилактики.

Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота (аденоинфекция) — остропротекающая болезнь, преимущественно телят. Характеризуется поражением органов дыхания, пищеварения и конъюнктивитами. У взрослых животных протекает обычно латентно.

Болезнь широко распространена во многих странах мира, в том числе и в России. Чаще болеют телята от 2-недельного до 4-месячного возраста. Более взрослые животные поражаются реже.

Характеристика возбудителя. Впервые вирус изолировал Клейн в 1939г. (США).

Вирус относится к семейству Adenoviridae, роду Mastadenovirus. Вирионы вируса представляют собой лишенный суперкапсидной оболочки двадцатигранник кубической симметрии диаметром 70—90 нм. Каждый вирион состоит из 252 капсомеров, из которых 240 являются гексонами (капсомер в окружении шести капсомеров), 12 — пентонами (капсомер в окружении пяти капсомеров) и длинного отростка с утолщением на вершине. Геном аденовирусов содержит одну линейную молекулу двуспиральной ДНК.

Устойчивость к физико-химическим воздействиям. Вирусы во внешней среде (в пределах pH 5,0—9,0) более устойчивы, чем другие вирусы: при 4 °С сохраняют активность в течение 90 дней; при 24 °С — 1—3 мес; при 36 °С — 15—60 дней; при 50 °С — инактивируются за 30—60 мин. Устойчивы к эфиру, хлороформу, трипсину, повторному замораживанию и оттаиванию, длительно сохраняются в лиофилизированном состоянии (более 5 лет). Абсолютный этиловый спирт и формалин в конечной концентрации 0,1—0,3 % инактивируют вирусы. УФ-лучи полностью инактивируют их за 30—60 мин.

Антигенная структура. У аденовирусов различают антигены трех видов: А, В и С.

Антиген А (связан с гексонами) — группоспецифичен, при иммунизации стимулирует образование группоспецифических комплементсвязывающих, преципитирующих антител, антител, реагирующих в реакции РНГА, а также вируснейтрализующих антител против гомологичного вируса.

Антиген В (связан с пентонами) — токсический фактор, ответственный за ранний цитопатический эффект.

Антиген С (связан с нитевидными структурами вирусного капсида) — типоспецифичен, он стимулирует выработку только типоспецифических антител, выявляемых в pH и РТГА.

В культуре клеток, инфицированной онкогенными вирусами, выявляют Т (трансплантационный) антиген. Вирусы первой подгруппы содержат в геноме родоспецифическую детерминанту, общую для вирусов млекопитающих.

Антигенная вариабельность. У крупного рогатого скота установлено 10 серотипов аденовирусов. Все 10 типов аденовирусов крупного рогатого скота на основании общих комплементсвязывающего и преципитирующего антигенов, выявляемых в РСК, РДП и РИФ, делят на две подгруппы. К первой подгруппе относят серотипы 1, 2 и 3, остальные типы — ко второй подгруппе. Вирусы первой подгруппы по антигенным и биологическим свойствам ближе к аденовирусам человека.

Антигенная активность. Вирус индуцирует в организме животных образование вируснейтрализующих, комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

Культивирование вирусов. Для культивирования аденовирусов крупного рогатого скота используют культуры клеток из тканей этих животных: почки эмбриона коровы (ПЭК), тестикулы бычка (ТБ), легкие эмбриона коровы (ЛЭК). Вирусы вызывают в клетках характерный цитопатический эффект (округление клеток и образование из них гроздевидных скоплений).

Аденовирусы крупного рогатого скота не размножаются в куриных эмбрионах и непатогенны для лабораторных животных, кроме некоторых онкогенных штаммов (3 серотипа), которые вызывают опухоли у новорожденных хомячков.

Вирусы первой подгруппы хорошо репродуцируются в культуре клеток ПЭК, ЛЭК и ТБ с образованием в них одного ядерного включения неправильной округлой формы.

Для вирусов второй подгруппы используют культуру клеток ТБ или ЛЭК, в которых они продуцируют множественные внутриядерные включения правильной округлой формы.

В последние годы для культивирования аденовирусов первой и второй подгрупп предложена перевиваемая культура клеток почки теленка Т-1 (Таурус-1).

Гемагглютинирующие свойства. Гемагглютинирующая активность установлена у аденовирусов первой подгруппы в отношении эритроцитов белых крыс и в низких титрах — эритроцитов белых мышей. Некоторые штаммы вирусов второй подгруппы приобретали гемагглютинирующие свойства после предварительной их концентрации. Более четкие результаты РТА получают при температуре 4 °С. Спектр гемагглютинирующей активности многих штаммов аденовирусов еще не изучен.

Гемадсорбирукнцие свойства. Не установлены.

Онкогенные свойства. Обнаружены у штамма WBR-1 для новорожденных хомячков.

Экспериментальная инфекция. Воспроизводится только на телятах 15—30-дневного возраста, лучше на безмолозивных. У животных старшего возраста болезнь протекает хронически.

Клинические признаки. Инкубационный период болезни длится 4—7 дней. Течение болезни зависит от условий кормления, содержания, возраста телят. Наиболее остро она протекает у молодняка 5—20-дневного возраста, сопровождается подъемом температуры тела до 41,5 °С, слезотечением, слизистыми, затем слизисто-гнойными истечениями, кашлем, затрудненным дыханием. У телят наблюдают слабость, понос, иногда с примесью крови в фекалиях. Смертность может достигать 60 %. У животных старшего возраста болезнь часто приобретает хроническое течение. Переболевшие телята отстают в росте и долго кашляют. Таким образом, для аденовирусной инфекции характерно преобладание респираторного, конъюнктивального или кишечного синдрома.

Патологоанатомические изменения. При вскрытии обнаруживают признаки катарально-геморрагического гастроэнтерита, изменения в органах дыхания (очаговые уплотнения, ателектаз и эмфизему легких). Регионарные лимфатические узлы увеличены. В клетках легочной ткани, слизистых оболочек трахеи, бронхов, кишечника и паренхиматозных органов находят внутриядерные включения.

Локализация вируса. От клинически больных животных аденовирусы изолируют из проб с конъюнктивы, носовой полости, миндалин, из крови и фекалий, а также из паренхиматозных органов и лимфатических узлов погибших телят. Переболевшие животные длительное время остаются вирусоносителями. Характерное биологическое свойство аденовирусов — тропизм к лимфоидной ткани.

Источники инфекции. Основной источник аденовирусной инфекции — больные животные, которые выделяют вирус в окружающую среду с истечениями из носа и фекалиями, а также вирусоносители. Заражение происходит воздушно-капельным, алиментарным путем и через конъюнктиву. Передача инфекции возможна через корма, подстилку, загрязненные выделениями больных животных.

Диагностика. Диагноз ставят, основываясь на анализе эпизоотологических, клинических данных, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований. При этом решающее значение имеют лабораторные исследования, так как сходную патологию могут вызвать вирусы ПГ-3, инфекционного ринотрахеита, диареи, респираторно-синтициальной инфекции, а также хламидии и другие агенты. Поэтому поступивший материал исследуют в лаборатории параллельно на все вышеуказанные инфекции, используя диагностические наборы, выпускаемые биологической промышленностью.

Взятие и подготовка материала. В лабораторию отправляют паралогический материал от больных животных, взятый в первые со дня болезни при выраженной клинической картине или от животных, убитых с диагностической целью в острой стадии заболевания.

От больных животных берут смывы со слизистых оболочек носа, глаз и прямой кишки с помощью стерильного ватно-марлевого или поролонового тампона; кровь в первые 3 дня заболевании (не менее чем от 10 животных) и через 3 нед от тех же животных (дли получения парных сывороток).

От животных, убитых с диагностической целью, берут кусочки легких, селезенки, слизистые оболочки носовой полости, трахеи, кишечника, регионарные лимфатические узлы.

Кусочки органов массой до 20 г помещают в стерильную посуду (пробирки или пенициллиновые флаконы с резиновыми пробками); ватно-марлевые тампоны (смывы) — во флаконы с раствором Хенкса или физиологическим раствором. Материал в термосе с охлаждающей смесью и сопроводительное письмо доставляют в лабоораторию с нарочным.

В лаборатории флаконы с тампонами встряхивают 2—3 мин, отжимают и удаляют, а содержимое флаконов центрифугируют. Надосадочную жидкость используют для выделения вируса, из осадка клеток делают мазки для РИФ.

Из кусочков органов убитого животного готовят мазки-отпечатки для РИФ и 10%-ную суспензию вируса для его выделения.

Лабораторная диагностика. Индикация вируса. В патологичсском материале ее проводят путем обнаружения вирусного антигена в серологических реакциях: РИФ, ИФА, РСК, РДП. Для этой цели в РИФ используют флуоресцирующие антитела (из диагностических наборов) к вирусам ПГ-3, ВД, ИРТ, PC, аденовирусам первой и второй подгрупп. Кроме того, для индикации аденовирусов иногда проводят обнаружение в мазках-отпечатках внутриядерных телец-включений, выявление которых имеет ориентированный характер.

Для обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты в смывах и фекалиях используют ДНК-зонд, разрабатывают ПЦР.

Изоляция вируса. Выделение вирусов проводят в первично-трипсинизированных культурах клеток эмбрионов крупного рогатого скота (почки, легкие) и тестикул бычка. В последние годы чаще используют перевиваемые линии клеток (почки, легкие), довольно успешно выделяют вирусы на перевиваемой культуре клеток почки теленка (Т-1), а вирус диареи — на эпителии коронарных сосудов теленка (КСТ). Зараженные и контрольные культуры клеток инкубируют при 37 — 38°С до 7—14 дней, ежедневно просматривая под микроскопом для выявления цитопатического действия. Специфические изменения в клетках, зараженных аденовирусами, начинаются с периферии монослоя, который разрывается, клетки округляются и собираются в конгломераты, похожие на грозди винограда. Цитопатический эффект сопровождается образованием внутриядерных включений.

Изолят считают выделенным, если он вызывает стабильное, однотипичное ЦПД не менее чем в трех последовательных пассажах. В этом случае возможно его последовательное идентифицирование. При отсутствии ЦПД в трех пассажах проводят четвертый пассаж с попыткой выявления вируса в монослойной культуре клеток на покровных стеклышках методом РИФ. При отрицательной реакции выделение вирусов прекращают.

Выделение вирусов на естественно-восприимчивых лабораторных животных и на куриных эмбрионах не применяют.

Идентификация выделенного вируса. Ее проводят в серологических реакциях: РИФ, РСК, РДП, PH, РТГА. Чаще всего используют РИФ с двумя флуоресцирующими сыворотками, соответствующими двум подгруппам (первой и второй). Типирование аденовирусов осуществляют в научно-исследовательских учреждениях, имеющих типоспецифические сыворотки и вирусы 10 типов аденовирусов. Для этой цели используют PH, а если выделенный вирус обладает гемагглютинирующей активностью, ставят РТГА по общепринятым методам.

Ретроспективная диагностика. Ее проводят с целью обнаружения специфических антител в сыворотке крови переболевших животных в РНГА, ИФА, непрямой РИФ. РСК и РДП, используя парные сыворотки крови, взятые в первые 2—3 сут болезни и через 2—4 нед. Диагностическое значение имеют обнаружение 4-кратного и большего нарастания титра антител во второй сыворотке переболевшего животного и увеличение ееропозитивных проб.

Дифференциальная диагностика. На основании эпизоотологических, клинических данных и патологоанатомических изменений точный диагноз на аденовирусную инфекцию поставить трудно из-за сходства ее с парагриипом-3, вирусной диареей, инфекционным ринотрахеитом, респираторно-синтициальной инфекцией, хламидиозом и другими заболеваниями, поражающими респираторно-кишечный тракт животных. Кроме того, аденовирусная инфекция очень часто протекает в ассоциации с вышеназванными заболеваниями. Поэтому только лабораторные исследования, проводимые с использованием диагностических наборов к указанным болезням, помогут правильно поставить диагноз.

Иммунитет и специфическая профилактика. Вопросы иммунитета при аденовирусной инфекции изучены недостаточно. Это, очевидно, связано с множеством типов возбудителя и латентным течением самой инфекции у взрослых животных. Установлено, что переболевшие и вакцинированные телята приобретают иммунитет к заражению вирусом гомологического типа и вирусам, относящимся к аналогичной антигенной подгруппе. Пассивный иммунитет создают антитела молозива в пределах 2—2,5 мес. Высокой эффективностью обладают секреторные антитела слизистой оболочки респираторного тракта.

В нашей стране применяют инактивированную димерэтиленаэросил вакцину из штаммов двух подгрупп аденовирусов крупного рогатого скота, а также бивалентную вакцину, содержащую аденовирусы двух подгрупп и возбудитель пастереллеза. У вакцинированных коров титр антител в крови на достаточно высоком гриппе сохранялся в течение 6 мес после отела, у вакцинированных телят — более 4,5 мес.

65. Характеристика вируса бешенства. Вирус "фикс" и уличный вирус Работы Л. Пастера. Биологические препараты для специфической профилактики и лечения бешенства.

Бешенство - особо опасная остропротекающая болезнь, с поражением ЦНС.

Болеют теплокровные животные и человек. Болезнь проявляется буйством, параличами и агрессивностью обычно с летальным исходом. Зооантропонозное заболевание.

Болезнь известна давно. 2300 лет до н.э. было описано 5 признаков болезни.

У собак1.открытый рот2. слюнотечение (как веревка свисает).3. голос хриплый.

4. уши свисают.5. хвост висит.

У человека первым описал Корнелий Цельс в 1 веке н.э. Гидрофобия - боязнь воды. Заразительность слюны установил в 1804 г Цинке.

В 1882 г-1885 Пастер и Ру доказали тропизм вируса к нервной ткани.

· Пастер с учениками проводил пассаж через мозг кролика и вирус сократил инкубационный период до 5-6 дней и при подкожном введении не вызывал болезнь. Такой вирус был назван fixe, т.е. фиксированным, который используется при приготовлении вакцины. 133 пассажа.

· Батист спас детей от бешеной собаки, сам был покусан. За детей ему дали премию в 1000 франков.

· В 1886 году Мечников и Гамалея открыли станцию по прививкам в Одессе, Москве и СПб.

· 1887 г.Бабеш (румын) и 1903 г. Негри (итальянец) обнаружили тельца включения - поэтому они называются Бабеша-Негри.

· 1890 г. Ру и Нокар описали заразительность слюны за 3-8 дней до клинических признаков.

· 1885 г., 6 июля была сделана первая вакцинация вирусом fixeмальчику 9 лет (Жозеф Мейер) 14 покусов. А позже пастуху Батисту.

· 1903 г. Ремленже и Риффат-бей- доказали что возбудитель бешенства вирус.

· 1907 г. Ферми приготовил вакцину из головного мозга зараженных вирусом fixe кроликов. Вакцина сухая сейчас не применяется, давала осложнения.

семейство Rhabdoviridae

род Lyssavirus

вид Rabies virus

РНК содержащий, однонитчатый с оболочкой, нейротропный. Уличный имеет размер 80-180 нм, пулевидной формы. Вирус fixe сферический “о” не чувствителен к эфиру, хлороформу. РНК вируса нитьевидная, имеет фермент РНКа зависимую РНК полимеразу. Спиральный тип симметрии.

Имеет 2 оболочки капсида и пеплос (сеперкапсида) с выступами. Вирус имеет 5 белков, транскриптазу 5 генов, содержит липиды 22 %. Размножается в цитоплазме клетки где и образует тельца включения. НК вируса однонитчатая имеет 22 больших витка и на одном конце 5 уменьшающихся витков. Это и придает вид пули.

Антиген вируса преципитирующий, комплемент связывающий, содержит антиген во внутренней оболочке вируса. В наружной есть антиген – гемагглютинин, улавливается в РТГА (эритроциты гусей), вирус нейтрализующий антиген и цитолизины.

В организме вырабатываются антитела - комплементсвязывающие, преципитирующие, вируснейтрализующие, антигемагглютинины.

Цитолизины в присутствии комплемента, интерферон и интерференция играют большую роль.

Устойчивость

довольно устойчив к воздействию физических, химических и биологических факторов, но термолабилен. 50^оС убивает за 1,5 часа, 56^оС - 15 минут, 60^оС - 10 мин, 80-100^оС - 1 минута.

При температуре + 4^оС в кусочках головного мозга сохраняется несколько месяцев.

Температура - 20-4^оС - несколько лет. Лиофильновысушенный 3-4 года.

Губительно действует формалин, лизол, сулема, хлорамин. УФЛ - 5-10 мин.

Глицерин 50% консервирует при + 4 до 90 дней.

В земле на глубине 1 метр до 5 недель В головном мозге в трупе до 90 дней.

Культивируется в условиях лаборатории

А) Через мозг кроликов

Б) Заражение б.мышей в кончик носа и в мозг, наблюдать 30 дней.

В) КЭ - 7дневные в желток и на ХАО.

Г) КТ-почек хомяков, свиней, телят.

В культуре клеток не вызывает дегенерацию ткани, нет ЦПД.

Вирус бешенства обладает изменчивостью по РН различают серотипы вируса.

По патогенности различают следующие виды вируса.

· Природный (уличный).

· Fixe - фиксированный получен Луи Пастером.Антигенные свойства вируса уличного и фиксированного оказались идентичными.

· Fluri получен от девочки и адаптирован к мозгу 1-дн.цыплят, затем к КЭ через заражение в желточный мешок. Проведено несколько тысяч пассажей.

· Вирус дикования (от песцов), оленей арктической.

· Kelev-6 от собаки вирус SAD.

Вариант Fluri (Lep, Hep) - высоко пассажированные варианты утратили патогенность для всех видов живых организмов, при любом виде и методе заражения, в мозгу не образует тельца включения Бабеша-Негри.

Симптомы.

Инкубационный период от нескольких недель до 1 года. В среднем от 2 до 8 недель.

Время инкубационного периода зависит от вида животного, возраста, резистентности, количества попавшего в организм вируса и его вирулентности, места локализации и характера раны. Чем меньше рана, чем она дальше от головы, длина инкубационного периода больше.

Поражается головной и спинной мозг, слюнные железы, роговица глаза.

Вирус попадает в организм чаще через укусы или повреждения кожи и попадания слюны.

Патогенез. Вирус попав со слюной в организм на месте укуса может находится до 2-х недель, далее по нервным стволам до ЦНС, а из головного мозга центробежно в слюнные железы и роговицу.

Форма проявления:буйная и паралитическая, тихая.

При бешенстве может быть скрытое течение болезни, носительство и редко выздоровление.

У КРС - болезнь протекает как атония рубца, отказ от корма, т.к.паралич глотки, слюнотечение. Признаки корова подавилась.

Для буйной формы устремление вперед, старается сорваться с привязи, хрипло мычит, бросается на препятствия, течет слюна.

Паралитическая встречается чаще. Нарушена координация движений. Снижение аппетита и удоя, температура 40-41^оС. Запрокидывание головы. Смерть через 3-6 дней.

У овец, свиней, лошадей протекает болезньв 2-х формах: буйной и паралитической.

У лисиц исчезает чувство страха, могут нападать на животных и людей или становятся очень ласковыми.

У собак в буйной форме или тихой.

Буйная форма через 8-11 дней после покуса. Собака бросается на ж-х и человека, извращенный аппетит, грызет разные предметы. Хриплый голос.

Тихая форма - затрудненное глотание, слюнотечение, паралич нижней челюсти, конечностей.

Гибель через 2-4 дня.

У человека от заражения до начала болезни проходит 15-45 дней и до 3-месяцев,

а может быть до года.

Смерть от начала болезни через 5-7 дней с явлениями гидрофобии, аэрофобии, параличей и судорог. Страшнее болезни чем бешенство для человека нет.

Клинические признаки бешенства

· Изменение голоса;

· Судороги, параличи;

· Слюнотечение;

· Светобоязнь;

· Агрессивность или ласковость;

· Выпадение третьего века;

· Поедание несъедобных предметов;

· Нападение на объекты неживой природы;

· Выход диких животных в дневное время в населенные пункты.

Лабораторная диагностика

Лабораторные методы – вирусологический и серологический.

Для исследования при жизни посылают слюну, отпечатки с роговицы.

Посмертно головной мозг (аммониевы рога, мозжечок), слюнные железы и роговицу, поясничный отдел спинного мозга.

Из присланного материала готовят мазки или отпечатки, гистосрезы, мазки из роговицы глаза можно готовить при жизни (тампон). Мазки фиксируют в ацетоне и окрашивают, Вирус образует тельца включения, которые видны при окрашивании по Михину и Муромцеву, при обычной микроскопии.

Находят вирус в мазках в виде телец-включения, которых может быть много или мало, что зависит от стадии протекания болезни.

Методы лабораторной диагностики бешенства

· гистологический метод;

· реакция диффузной преципитации (РДП);

· реакция иммунофлюоресценции (РИФ);

· иммуногистохимический метод (ИГХ);

· полимеразная цепная реакция (ПЦР);

· иммуноферментный анализ (ИФА);

· биопроба на мышах;

· вирусовыделение на культуре клеток;

· латекс-агглютинация.

РИФ – золотой стандарт в диагностике бешенства

Достоинства:

v Быстрота выполнения (2-3 часа);

v Высокая чувствительность и специфичность;

v Относительная дешевизна.

Недостатки:

v Отсутствие инструментального учета;

v Субъективность оценки результатов;

v Необходимость обучения и опыта работы.

Для люминесцентной микроскопии используют метод флюоресцирующих антител.

Для выделения вируса проводят биопробу на белых мышах-сосунках. Заражают в головной мозг или п/к в кончик носа, КЭ в желток.

Идентификация вируса. Используют РИД, РН на лаб.ж-х и КК

Если покусан человек, то используют 18-20 мышат. Через 3 дня после заражения усыпляют 1, 2 мышат и исследуют мозг по РИД и РН.

Биопрепараты.

Лечебные - антирабическая сыворотка и гамма-глобулин (получают на лошадях), вирус fixe на ослах. Лечат только ценных животных до появления клинических признаков, не позднее 6-8 дней после покуса. Больных животных не лечат, а уничтожают, а трупы сжигают.

Профилактические - вакцины убитые (54) и живые (30). Диагностические - МФА, РДП.

Вакцинация - профилактическая - вакцинация клинически здоровых, не покусанных животных кошек, собак, однократно. Сухая фенолвакцина из мозга овец. Иммунитет до 8 месяцев через 3, 4 недели.

Вынужденная - покусанных животных или контактирующих с ними. Только высокоценных животных и не позже 6-8 дней после покуса.

Вакцины получают:

мозговые (Пастер на кроликах, Назаров на овцах все инактивированные фенолом, УФ.

яичные (на КЭ из штFlury).

культуральные на КТ - живые и убитые. Для инакт. - пастеровский шт. fixe, Внуково-32 для человека Щелково-51. Из живых Flury, HEP.

Пастеровский штамм fixe (от коровы) адаптированный к мозгу кролика и овец.

Шт. Flury от девочки адаптипрованный к мозгу 1 дневных цыплят, а затем КЭ.