Серологическая диагностика вирусных болезней. Сущность, виды и назначение серологических реакций.

Для диагностики вирусных болезней в ветеринарной практике при­меняются различные серологические реакции: РСК, РЗГА, РН (реак­ция нейтрализации вируса), РДП (реакция диффузной преципитации) и другие. В основе их лежит способность антител, находящихся в сы­воротке крови, реагировать со специфическими антигенами вирусов. Следовательно, для постановки любой серологической реакции обя­зательными компонентами являются антиген и антитело.

Антитела образуются в организме животных клетками лимфоидной ткани (В-лимфоцитами) на введение (при иммунизации) или по­падание (при заражении) какого-либо антигена и накапливаются, как в депо, в сыворотке крови. Антитела выполняют защитную роль, как фактор специфической защиты организма.

По химической природе антитела являются белками, специфичес­кими иммунными глобулинами (иммуноглобулины пяти классов) и содержатся преимущественно в гамма-глобулиновой фракции крови.

В зависимости от вида серологических реакций антитела, участву­ющие в них, называют по разному: в РСК - комплементсвязывающие; в РДП - преципитирующие (преципитины); в РН - вируснейтрализующие антитела; в РЗГА - антигемагглютицины и т.д.

Такое разнообразие антител объясняется различием антигенной структуры вирусов. В составе вирусов содержатся различные антиге­ны, которые стимулируют выработку различных по действию антител.

Антигены - это вещества белковой природы, которые при попадании (или введении) в организм парэнтеральным путем (т. е. минуя желудоч­но-кишечный тракт) вызывают образование антител. С образовавши­мися антителами антигены могут вступать в реакцию (специфическое взаимодействие) как в организме животного, так и вне организма (ин вит­ро, в пробирке), что и используется при постановке реакций. В результате такого взаимодействия происходит обезвреживание свойств антигена (вируса). Так, обезвреживание инфекционных свойств антигена (ви­руса) мы устанавливаем в реакции нейтрализации вируса, гемагглю- тинирующие свойства - в реакции задержки (торможения) гемагглютинации и т. д.

Вирусы содержат различные белки, отличающиеся друг от друга не только по строению, физико-биохимическим свойствам, но и по антигенности. По белковому составу, а, следовательно, и по антигеннос- ти вирусы не одинаковы, что и используется при их серологической дифференциации и идентификации. Так, вирус гриппа имеет 5 раз­ных антигенов: нейраминидазу, гемагглютинин, S-антиген и два мало­изученных антигена. Вирус ящура содержит ^антигена, вирус чумы КРС имеет преципитирующий и комплементсвязывающий антигены.

В зависимости от применяемых серологических реакций антиге­ны, участвующие в них, называются, так же как и антитела, по разному: в РСК - комплементсвязывающий антиген, в РН - антиген, вызываю­щий образование вируснейтрализующих антител, в РДП - преципи­тирующий антиген (преципитиноген), в РЗГА и РГА - гемагглютини- рующий антиген (гемагглютинин) и т.д.

Антигены у различных групп вирусов строго специфичны и могут реагировать только с соответствующими антителами. У вирусов, вхо­дящих в одну группу, некоторые антигены могут быть общими для всей группы (группоспецифические), другие антигены являются специфич­ными только для одного какого-либо штамма данной группы (штам- мо-специфические).

При постановке серологических реакций выявление антител или антигена основано на принципе специфичности их взаимодействия, т. е. антигены взаимодействуют только со специфическими антителами и наоборот. Поэтому в серологических реакциях один из этих компо­нентов (антиген-вирус, или антитело) должен быть заранее известным и по нему определяют второй (неизвестный в реакции) компонент. В связи с этим серологические реакции могут быть поставлены в двух вариантах:

а) с известными иммунными или гипериммунными сыворотками (диагностические сыворотки) для определения (идентификации и ти­пизации) вирусов, выделенных из исследуемого патологического ма­териала;

б) с известными антигенами (диагностикумами) для обнаружения антител и определения их количества в присылаемых для исследова­ния сыворотках крови, взятых от больных и переболевших животных. С помощью серологических реакций можно установить сроки появле­ния в крови антител у вакцинированных животных и выявить дина­мику антителообразования.

В качестве антигенов при постановке серологических реакций применяют:

а) надосадочную жидкость из суспензий органов, содержащих ви­русы, после многократных замораживаний и размораживаний с пос­ледующим центрифугированием;

б) культуральную жидкость из зараженных культур тканей;

в) материал (суспензия оболочек или куриного эмбриона, жидко­сти из полостей) из зараженных куриных эмбрионов;

г) содержимое афт, пустул, истечения и смывы из носа и других полостей, жидкости из полостей организма и т. д.

Антигеном может быть живой (нативный) вирус или обезврежен­ный (инактивированный, убитый) вирус. Иногда для повышения ка­чества и специфичности серологических реакций предварительно про­водят очистку и концентрацию антигена (вируса).

Сущность, техника постановки и учет реакции гемагглютинации (РГА).

РГА не относится к серологическим реакциям(!!!), так как в ней не уча­ствует иммунная сыворотка, т. е. антитела. В основе РГА лежит агглю­тинация, т. е. склеивание эритроцитов человека, животных и птиц под действием вируса. было установлено, что способность вызывать агглютинацию эритроцитов обладают не только вирусы гриппа, но и некоторые дру­гие представители миксовирусов (вирусы парагриппа, паротита, болез­ни Ньюкасла и др.), аденовирусы, вирусы оспы, некоторые нейротропные вирусы и другие. РГА используется для индикации (обнаружения) вирусов при проведении ориентировочной диагностики, для титрования вирусов по гемагглютинирующим свойствам (установление гемаг- глютинирующих единиц - АЕ). С помощью РГА нельзя иипировать и идентифицировать вирусы, т. к. в ней не участвует сыворотка (анти­тело). Гемагглютинацией обладают не все вирусы. Миксовирусы агг­лютинируют эритроциты многих видов животных, кур и человека. При постановке РГА нужно знать, какие эритроциты данным вирусом агг­лютинируются.

Основу феномена агглютинации, вызываемого вирусами, составляет адсорбция вирусов на поверхности эритроцитов, сопровождающаяся склеиванием (агглютинацией) последних и выпадением в осадок. Ме­ханизм РГА заключается в следующем: на поверхности эритроцитов имеются рецепторы мукопротеидной природы, способные адсорбиро­вать до 10.000 вирионов, а на поверхности гемагглютинирующих ви­русов располагаются гемагглютинины - сложные белковые тела с энзиматической активностью. При смешивании эритроцитов с вируссо­держащей жидкостью гемагглютинины вируса при помощи фермента муциназы вступают во взаимодействие с рецепторами эритроцитов, в результате чего происходит адсорбция вирусов на эритроцитах. Вирионы, адсорбированные на одном эритроците, способны свободны­ми поверхностями соединяться с другими эритроцитами, образуя при этом мостики между ними, ч го и приводит к склеиванию (агглютина­ции) эритроцитов.

Адсорбция вирусов на эритроцитах является энзиматическим про­цессом. Через некоторое время после проявления гемагглютинации связь между вирусами и эритроцитами нарушается, так как вирусная муциназа разрушает рецепторы эритроцитов и вирусы элюируют (от­соединяются) с эритроцитов. Это надо иметь в виду при учете реак­ции. После элюции вируса эритроциты оседают на дно пробирки в виде бугорка (холмика, пуговки). Использованные в РГА эритроциты вто­рично этим же вирусом не агглютинируются, т. к. чувствительные к данному вирусу рецепторы у эритроцитов уже разрушены, но могут быть агглютинированы другими вирусами, к которым сохранились рецепторы.

В качестве антигена для РГА берут любой материал (патматериал в виде суспензии из органов, смывы, материал из зараженных кури­ных эмбрионов, культур ткани и др.), в котором предполагается нали­чие вируса. Материал должен быть жидким, без крупных частичек.

Эритроциты применяют в виде 1% взвеси в физиологическом ра­створе. Они могут быть свежеприготовленные или консервированные.

Физиологический раствор для постановки реакции используют с рН 7,0 - 7,4.

Для постановки ориентировочной РГА на чистое и хорошо обез­жиренное предметное стекло наносят одну каплю вируссодержащего материала, к ней добавляют одну каплю 5%-ной взвеси эритроцитов и перемешивают стеклянной палочкой. В положительных случаях че­рез несколько минут произойдет агглютинация эритроцитов в виде об­разования хлопьев.

При постановке реакции пробирочным способом используют се­рологические пробирки или панели (пластины из стекла или оргстек­ла) с лунками. В этом случае предварительно готовят двукратные раз­ведения вируссодержащего материала, начиная с 1:10 (и далее дву­кратные разведения: 1:20, 1:40, 1:80 и т.д.) и до 1:1280 (иногда и более высокие). К каждому из разведений вируссодержащего материала, взя­тых в объеме по 0,5 мл, затем добавляют по 0,5 мл 1%-ной взвеси эрит­роцитов и пробирки после встряхивания оставляют в покое на 30-60 ми­нут при комнатной температуре, а затем учитывают результаты. Оце­нивают реакцию в крестах (плюсах).

При оценке реакции в крестах обращают внимание на характер осад­ка. Если эритроциты осели тонким слоем равномерно по дну пробир­ки (в виде зонтика), реакцию оценивают в четыре креста (++++). При оседании эритроцитов в виде зонтика, но с наличием менее равномер­ного распределения его по дну - три креста (+++). Если эритроциты осели в виде зонтика, но с волнистыми краями и в центре дна имеется более толстый слой из осадка неагглютинированных эритроцитов, ре­акцию считают в два креста (++). Значительное оседание эритроци­тов плотным диском в центре пробиркой с зернистой каймой по кра­ям (при наклоне пробирки эритроциты сползают) оцениваются в один крест (+). Если же эритроциты оседают на дно пробирки в виде хол­мика (бугорка) с ровными краями, при наклоне пробирки сползают такую реакцию считают отрицательной (-).

Титром вируса считается то наибольшее разведение его, которое способно давать реакцию гемагглютинации не менее чем в два (++) креста. Такое разведение содержит одну гемагглютинирующую еди­ницу (1 АЕ).

Практика: 2 компонента: аг, однопроцентные эритроциты. (только гемагглютинирующий вирус)

Цель постановки:

-определить является ли вирус гемагглютинирующим

-определить титр вируса

Механизмы реакции:

У эритроцитов имеются рецепторы мукопротеидной природы, а у вирусов – фермент муциназа, и при их соединении одна вирусная частица может соединиться с несколькими эритроцитами, за счет чего на стекле образуются хлопья, а в лунках – зонтики. Реакция непродолжительная, через некоторое время муциназа вирусов разрушает рецепторы эритроцитов, и они оседают на дне в виде пуговки.

Реакцию можно поставить в 2х вариантах:

1. является ли вирус гемагглютинирующим.

Берут каплю эритроцитов и каплю вируса вносят на предметное стекло. В положительном случае (если вирус гемагглютинирующий) – хлопья, если отрицательный случай, то жидкость равномерно окрашивается в красный цвет.

2. используют планшеты\планшетки (такая форма с лунками, усеченными пробирками)

Вносят 0,2 мл физ. Раствора во все, и в первую 0,2 мл вируса. Перемешивают в первой лунке, потом переносят вирус во 2,3,4 и тд. Делают ряд последовательный двухкратных разведений.

Разведение по лункам: 1- 1:2; 2- 1:4; 3- 1:8, 4- 1:16 и тд.

Затем в каждую лунку вносят по 0,2 мл 1%-ых эритроцитов.

Контакт 20-30 минут

Учет

Планшетку под углом 45 градусов – эритроциты стекают в виде слезки (мало вируса).

Параллельно ставят контроь (0,2 мл физ р-ра, 0,2 эритроцитов) на самоагглютинацию эритроцитов

Сущность, техника постановки и учет реакции задержки гемагглютинации (РЗГА).

РЗГА широко применяется в практике как для выявления и оп­ределения титра антител в сыворотке крови больных и вакциниро­ванных животных, так и для идентификации выделенных вирусов по известной сыворотке. Ставить эту серологическую реакцию мож­но только с теми вирусами, которые обладают гемагглютинирующими свойствами.

Сущность РЗГА заключается в том, что, если к вирусу, обладающе­му гемагглютинирующими свойствами, добавить сыворотку, содержа­щую специфические вирусу антитела, и смесь выдержать в контакте 30-60 минут, а затем внести взвесь эритроцитов, гемагглютинация не наступит, т.е. произойдет задержка (торможение) гемагглютинации. Следовательно, здесь гемагглютинирующая способность вируса нейт­рализуется специфическими антителами.

При постановке реакции следует иметь в виду, что некоторые жид­кости организма (сыворотка крови, моча, слюна, молоко и др.) могут содержать ингибиторы, которые могут тормозить реакцию и задержи­вать гемагглютинацию. В этих случаях нормальная сыворотка, т. е. сы­воротка от здоровых животных, может дать задержку гемагглютинации, что приведет к ошибочным результатам. В сыворотках крови некото­рых здоровых людей и животных выявлено два типа ингибиторов - тер­мостабильные и термолабильные. Термолабильные ингибиторы обна­руживаются в бета-фракциях глобулина и они обладают свойствами бета-глобулина, подавляют гемагглютинацию, нейтрализуют вирус и являются важным фактором противовирусного иммунитета. Они ме­шают постановке РЗГА и от них избавляются инактивированием сы­воротки при 56-65°С в водяной бане 30 минут. Термостабильные ин­гибиторы (ингибиторы Френсиса) содержатся в альфа-фракции гло­булина, они устойчивы к высоким температурам (даже к кипячению) и действию щелочи, подавляют гемагглютинацию, но вируснейтрали- зующими свойствами не обладают. Удаляют термостабильные инги­биторы из сывороток крови обработкой сывороток углекислым газом, фильтратом культуры Вибриона холеры или перйодатом калия.

Для постановки РЗГА необходимо предварительно провести титрацию вируса в РГА, чтобы определить 1 АЕ. При постановке РЗГА вирус берут в титре 4 АЕ, т. е. разведение в 4 раза меньшее, чем был титр вируса в РГА. Например, титр вируса, содержащий 1 АЕ, равен 1:64, значит 4 АЕ будет содержаться в разведении вируса 1:16.

Все сыворотки перед постановкой РЗГА прогревают для удале­ния термолабильных ингибиторов в течение 30 минут при темпера­туре 56-65°С в зависимости от вида животных.

Для постановки реакции в одном ряду пробирок или лунок готовят разведения сыворотки на физиологическом растворе. Обычно в пер­вой пробирке готовят разведение 1:10, а далее из него двухкратные разве­дения до 1:1280 и иногда более высокие. Затем из этого ряда по 0,25 мл соответствующих разведений сыворотки переносят во второй ряд про­бирок и туда же добавляют по 0,25 мл вируса, содержащего 4 АЕ. Встря­хиванием пробирок жидкость перемешивают и смесь выдерживают 30-60 минут в контакте при комнатной температуре или в термостате. После этого во все пробирки вносят по 0,5 мл 1%-ной взвеси эритро­цитов, пробирки встряхивают и вновь выдерживают смесь в контакте 30-60 минут. Параллельно ставят контроли:

а) контроль сыворотки на спонтанную агглютинацию: к 0,25 мл сы­воротки, в разведении 1:20 добавляют 0,25 мл физраствора и 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов (сыворотка не должна давать агглютинации);

б) контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию; к 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов добавляют 0,5 мл физраствора. Агглюти­нации не должно быть;

в) контроль реакции с нормальной сывороткой и антигеном - агг­лютинация должна быть. / СЦ

В положительных случаях при учете РЗГА будет отсутствовать аг­глютинация эритроцитов, в то время как этот же вирус без добавления сыворотки и с нормальной сывороткой будет вызывать четкую гемаг­глютинацию. С помощью РЗГА можно определить нарастание титра антител в процессе динамики болезни. Титром антител считается наи­высшее разведение сыворотки, которое задерживает проявление гемаг­глютинации.

С пары: компоненты: сыворотка (известная диагностическая положительная отрицательная\неизвестная исследуемая), антиген (берут в количестве 4 ГАЕ), однопроцентные эритроциты.

Цель постановки: идентификация вируса, титр антител и динамика их нарастания

Учет реакции: в первой пробирке, где больше всего сыворотки – эритроциты оседают на дно в виде пуговки; далее начинается агглютинация; в конце – зонтик.

Диагностика: чума плотоядных, гепатит плотоядных, псевдочума

Сущность, техника постановки и учет реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

В последние годы при диагностике вирусных болезней все шире вне­дряется РНГА(РПГА), которая более чувствительная, чем прямая РГА и является специфической серологической реакцией.

Целый ряд вирусов способны адсорбироваться на эритроцитах и при этом не вызывать их агглютинацию. Если же к таким эритроци­там, сенсибилизированным антигеном, т. е. несущим на себе адсорби­рованный вирус, добавить иммунную специфическую сыворотку про­исходит агглютинация эритроцитов с помощью антител иммунной сы­воротки.

В настоящее время при некоторых вирусных болезнях разрабаты­ваются и выпускаются предприятиями биопромышленности такие эритроцитарные диагностикумы. Эритроциты для лучшей адсорбции на них вируса (или антител) предварительно обрабатывают раство­ром таннина путем смешивания равных объемов 2,5% взвеси эритро­цитов и раствора таннина (1:200.000), затем центрифугируют и отмы­вают фосфатным буфером. На обработанные таннином эритроциты затем адсорбируют вирус и получают эритроцитарный антиген, кото­рый затем и используют для исследования сывороток крови на нали­чие антител. С целью выявления вируса в исследуемом материале и для его идентификации и типизации применяют эритроцитарный диагностикум, сенсибилизированный специфическими антителами, т. е. несущий на себе адсорбированные антитела.

Для постановки реакции в пробирки вносят по 0,5 мл соответству­ющего разведения исследуемой сыворотки (при исследовании на наличие антител) и 0,1 мл взвеси сенсибилизированных вирусом эритроцитов (эритроцитарный антиген). В качестве контролей ста­вят параллельно реакцию с положительной и нормальной сыворотка­ми и этим же эритроцитарным антигеном. Пробирки после встряхи­вания ставят в термостат или оставляют при комнатной температуре на 40-60 минут и учитывают результат. Если исследуемая сыворотка иммунная, т. е. содержит антитела, происходит агглютинация эритроцитов (положительная реакция, животное инфицировано). Эта реак­ция более перспективна, чем прямая, для диагностики вирусов, и особен­но тех, которые сами не обладают гемагглютинирующими свойствами.

Для выявления вируса в патологическом материале используют эритроцитарный диагностикум с адсорбированными антителами. Если в патматериале содержится вирус специфичный для антител, насту­пает агглютинация эритроцитов.

С пары: Компоненты: сыворотка и антигенный эритроцитарный диагностикум (получают на биокомбинатах, для получения используют эритроциты быка, барана, лошади, человека; нарабаотывают для вирусов, которые являются не гемагглютинирующими)

Сущность: берут эритроциты, обрабатывают раствором таннина, формалином, после проводят сенсибилизацию вирусов. Эритроцит меняет форму (становится с выпуклостями). Вирус прикрепляется к неровным частям эритроцита.и тд (выше)

Учет реакции: АТ много, вируса много – зонтик, в остальных пробирках менее выраженный зонтик. В конце пуговка.