Цель постановки, компоненты и сущность ПЦР.

Одна из наиболее важных задач вирусологии - максимально ранняя диагностика возбудителей инфекционных болезней животных и птиц. Решение этой задачи обеспечивается различными методами. Однако большинство из них оказываются малоэффективными или принципиально неприемлемыми по причине, главным образом, их низкой чувствительности.

Поэтому в последнее время все большее распространение получают новейшие методы диагностики, основанные на обнаружении в исследуемых клинических образцах специфических нуклеотидных последовательностей генома возбудителя. Наибольшее внимание среди этих методов привлекает полимеразная цепная реакция - ПЦР (PCR, polymerase chain reaction), разработанная Кэрри Мюллисом в 1983 году. Это одно из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии. За разработку ПЦР-анализа К.Мюллис в 1993 году был удостоен Нобелевской премии в области химии. Появление метода ПЦР было обусловлено достижениями в области молекулярной генетики, прежде всего расшифровкой нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов, и благодаря открытию уникального фермента taq-ДНК-полимеразы, содержащегося у бактерий, обитающих в гейзерах. Особенность этого фермента заключается в его исключительной термостойкости (период полужизни при 95ºС составляет 40 минут) и высокой рабочей температуре – оптимум работы 72ºС.

Часто ПЦР описывают как метод, с помощью которого можно находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл. "Иглой" является крошечный фрагмент генетического материала, а ПЦР не только точно обнаруживает этот фрагмент, но и затем, используя естественное свойство ДНК- репликацию (размножение), делает его копии.

В течение нескольких часов с помощью ПЦР из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул.

Сущность метода. Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплиментарное дополнение обеих. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. Суть метода заключается в том, что маркировав такими блоками специфический только для данного вида (но не для других видов) участок ДНК, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок.

Для осуществления такого процесса в пробирке, используют две генетические пробы, называемые праймерами, которые и служат в качестве затравки для синтеза выбранного участка ДНК. При внесении в исследуемую пробу праймеры подобно паре генетических детективов “прочесывают” раствор в поисках участка, которому они комплементарны и, следовательно, способны присоединится, образовав двунитчатый стартовый участок. После присоединения (отжига) праймеров начинается воспроизведение с помощью фермента - Taq - полимеразы специфического фрагмента ДНК, вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации - это и есть цепная реакция в ПЦР. В результате количество копий фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии и через 25 циклов амплификации синтезируются 10⁶ копий фрагмента. В течение 30-40 циклов нарабатывается количество ДНК, достаточное, чтобы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле.

При ПЦР - диагностике размножению подвергается не возбудитель, а только ее ДНК, причем не вся молекула ДНК, а только определенный фрагмент, являющийся маркером данного возбудителя.

Взятие и пересылка материала. Требования к взятию образцов и пересылке биологического материала упрощены, так как нет необходимости сохранять возбудитель в живом виде, по сравнению с бактериологическими и вирусологическими методами.

Материалом для ПЦР могут быть соскобы эпителиальных клеток, кровь и ее компоненты, костный мозг, плевральная, синовиальная и спинномозговая жидкости, моча и ее клеточный осадок, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, слюна, плевральный выпот, сперма, слезная жидкость, выделения молочных желез, молоко, смывы и другие биологические жидкости, биоптаты, секционный (аутопсийный) материалы, отделяемое везикул, фиксированные или парафинированные ткани. Биологическим материалом для ПЦР-диагностики может служить культуральная жидкость, куриные эмбрионы, клещи, сточные воды, почва, пищевые продукты, корма, сырье животного и растительного происхождения.

Оборудование и реактивы

Оборудование:

микролаборатория "Eppendorf" (Германия): автоматические пипетки, одноразовые наконечники для пипеток, пробирки (0,5; 1,5 мл), миксер, микроцентрифуга, термостат;

- вакуумный насос;

- холодильники -20°С, -70°С;

- амплификатор MiniCicler (MJ Research Inc., США); Приборы для амплификации в электрофоретическом формате и в режиме реального времени.

- источники питания GPS 200/400 и EPS 3500 XL (Pharmacia, Швеция);

- аппарат для электрофореза;

- источник УФ излучения (трансиллюминатор);

Реактивы:

1. РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза). 20 мкл р-ра ревертазы (20000 ед/мл)-1 шт.

2. Термостабильная ДНК-полимераза (Tag DNA-polymerasa). 50 мкл раствора ДНК-полимеразы (5000 ед/мл) - I шт.

3. Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP). 0,5 мл водного р-ра дезоксинуклеозидтрифосфатов с концентрацией 10 мМ каждого - 1 шт.

4. Контрольная матрица (Control DNA). 0,02 мл р-ра кДНК вариабельной области гена VP2 вируса ИББ в концентрации 0,0001 мкг/мл - 1 шт.

5. Праймер № 1. 0.1 мл водного р-ра олигонуклеотида в концентрации 1.0 О.Е./мл - 1 шт.

6. Праймер № 2. 0.1 мл водного р-ра олигонуклеотида в концентрации 1.0 О.Е./мл- 1 шт.

7. Пранмер № 3. 0.1 мл водного р-ра олигонуклеотида в концентрации 1.0 О.Е./мл- 1 шт.

8. Праймер № 4. 0,1 мл водного р-ра олигонуклеотида в концентрации 1,0 О.Е./мл- 1 шт.

9. 5-кратный реакционный буфер для ревертазы. 0,5 мл (250 mM Трис-HCl, рН 8,3,

250 mM KC1, 50 mM MgCb, 50 mM DTT, 2,5 mM спермидин) - 1 шт.

10. 10-кратный реакционный буфер для ПЦР. 1 мл (0,67 М трис-HCl, рН 8,8, 0,150

М (NH4)2S04 и 30 мМ MgCb) - 1 шт.

11. Термостабильная ДНК-полимеразa, Sequensing Grade (Tag DNA-polymerasa,

Sequensing Grade). 50 мкл р - ра ДНК - полимеразы, Sequensing Grade (5000 ед / мл) - 1 шт.

12. 5-кратный реакционный буфер для секвенирования. 1 мл (0,25 М трис-HCl, рН 9,0- lOMMMgCb)- 1шт.

13. Смесь дезокси-/дидезоксигуанозинтрифосфатов (d/ddG Mix). 0,2 мл 30 мкМ ddGTP и 20 мкМ каждого dNTP- 1 шт.

14. Смесь дезокси-/дидезоксиаденозинтрифосфатов (d/ddA Mix). 0,2 мл 350 мкМ ddATP и 20 мкМ каждого dNTP- 1 шт.

15. Смесь дезокси-/дидезокситимидинтрифосфатов (d/ddT Mix). 0,2 мл 600 мкМ ddTTP и 20 мкМ каждого dNTP- 1 шт.

16. Смесь дезокси-/дидезоксицитидинтри4)осфатов (d/ddC Mix). 0,2 мл 200 мкМ ddCTP и 20 мкМ каждого dNTP- 1 шт.

17. Т4 полинуклеотид-киназа (Т4 ПНК). 20 мкл р-ра Т4 полинуклеотид-киназы

(1000 ед/мл)- 1 шт.

18. 10-кратный буфер для ПНК. 0.1 мл (500 мМ трис-HCl (рН 7.5). 100 мМ MgCb.

50 мМ ДТТ и 1 мМ спермидин а)- 1 шт.

19. Раствор для остановки реакции секвенирования (Stop solution). 1,5 мл (10 мМ

NaOH. 95% формамида. 0,05% бромфенолового синего. 0,05% ксиленцианола)-1 шт.

20. Вода деионизованная - 1.5 мл.

21.Минеральное масло. 10 мл вазелинового масла- 1 шт.

22.Раствор "Д" 100 мл (4 М гуанидин-тиоцнанат, 25мМ Na-цитрат. 0,5% саркозил. 0.1М 2-меркаптоэтанол) -1 шт.

23. 10-кратный буфер для электрофореза ТВЕ (0.89 М трис-борат. 0.89М борная кислота. 0,1 М ЭДТА. рН 8.0) - 2 л.

24. Фенол о.с.ч. перегнанный:

25. Хлороформ (х.ч.):

26. Изоамиловый срирт;

27. Раствор акриламид/ бисакриламид (30% / 0,8%) 600 мл;

28. Мочевина о.с.ч.; 1,5кг;

29. Этанол 96% и 80%;

30. Раствор бромистого этидия (10 мг/мл) 0,5 мл - 1 шт.

31. Агароза (Sigma) 50 г. -1 шт.

32. Буфер для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола в формамиде) 0,5 мл. - 1 шт.

Этапы работы.

ПЦР – исследование включает в себя 3 стадии:

- выделение ДНК из образцов;

- проведение полимеразной цепной реакции;

- регистрация результатов (методом электрофореза в агарозном геле и др.).