Определение витамина С в крови

 

Материалы, посуда, реактивы:

5 % раствор метафосфорной кислоты (готовят на бидистиллированной воде);

0,0005 н раствор натриевой соли 2,6-ди-лоренолиндофенола (0,11 мг индикатора растворить в 1 л биди-стиллированной воды);

щавелевокислый натрий;

центрифуга;

фарфоровые кюветы для титрования;

специальная микробюретка для титрования.

Ход работы:

Кровь берут пипеткой (не менее 0,5 мл) в центрифужную пробирку, стенки которой покрыты легким слоем щавелевокислого натрия или калия, размешивают стеклянной палочкой и центри-угируют 20-30 минут при 3000 оборотов в минуту.

Из полученного центрифугата (плазмы крови) берут пипеткой 0,1-0,5 мл в сухую центрифужную пробирку, прибавляют той же пипеткой равное количество дистиллированной воды (промывая таким образом пипетку) и двойное количество свежеприготовленного 5% раствора метафосфорной кислоты. Размешивают и центрифуги-уют в течении нескольких минут.

 

Пример: 0,2 мл плазмы + 0,2 мл дистиллированной воды + 0,4 мл 5 % раствора метафосфорной кислоты.

 

Плазму, освобожденную от белка, титруют краской Тильманса (0,0005 н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола) из специальной микробюретки. При титровании легкие повороты винта двигают краску по бюретке. Медленно вытекая, краска образует на кончике бюретки капли, которые приходится снимать, дотрагиваясь до нее краем стенки сосуда, в котором находится титруемая жидкость.

Титрование следует производить обязательно на белом фоне в небольших углублениях (около 1 мл) молочного стекла или фарфора. Для титрования берут 0,1-0,5 мл плазмы, в зависимости от количества имеющегося материала, с расчетом, чтобы его хватило не менее чем на два параллельных титрования.

Холостой опыт производится с раствором метафосфорной кислоты и дистиллированной воды в соответственном объеме.

 

Формула вычисления полученных результатов:

 

,

где Х – содержание АК в плазме крови, мг% (миллиграмм-проценты);

а – объем краски Тильманса, затраченный на титрование плазмы, мл;

b – объем краски Тильманса, израсходованный на титрование в холостом опыте, мл;

T – поправка на титр краски Тильманса;

4 – разведение;

0,088 – число миллиграммов АК, соответствующее 1 мл затраченного 0,001 н раствора индикатора;

v – количество плазмы, взятой для титрования, мл.

 

Вычисляют поправку на титр индикатора (стр. 30).

 

Лабораторная работа № 4

Количественное определение витамина С

В растительном материале

 

Материалы, посуда, реактивы:

 

картофель, лимон, капуста свежая, киви;

5 % раствор соляной кислоты HCl;

0,001 н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола;

0,1 % раствор аскорбиновой кислоты;

0,001 н раствор иодноватокислого калия;

иодид калия KI;

1 % раствор крахмала – индикатора;

5 % раствор иодистого калия;

3 % раствор пероксида водорода Н₂О₂;

кварцевый песок;

микробюретка на 5 мл;

пипетки на 5 и 20 мл;

конические колбы на 50 и 100 мл;

стаканы на 100 мл;

мерный цилиндр на 250 мл;

мерные колбы на 100 мл;

воронка;

ступка фарфоровая.

 

А) Определение титра раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола

Установку титра приблизительно 0,001 н раствора 2,6-дихлор­фенолин­дофенола производят по аскорбиновой кислоте (АК) в день работы. 1 мл 0,1% раствора АК растворяют в 25 мл 2 % раствора серной кислоты.

5 мл этого раствора титруют 2,6-дихлорфенолиндофенолом до появления розового окрашивания. Отмечают затраченный на титрование объем реагента (а, мл). Такой же объем раствора АК титруют из другой микробюретки 0,001 н раствором иодноватокислого калия с прибавлением в колбочку перед титрованием нескольких кристаллов (не более 0,1 г) иодида калия и 5 капель 1% раствора крахмала. Титрование ведут осторожно до появления едва заметного синего окрашивания и отмечают затраченный на титрование объем (b, мл).

В первом и во втором случае были оттитрованы одинаковые объемы АК, следовательно, количества затраченных иодида калия и 2,6-дихлор­фенолиндофенола эквивалентны друг другу. 1 мл 0,001 н раствора иодида калия эквивалентен 0,088 мг аскорбиновой кислоты (молекулярный вес аскорбиновой кислоты – 176, а грамм-эквивалент – 88). Отсюда:

 

0,088 · b = Т · а, тогда Т =0,088 · b / а,

где Т – титр 2,6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте.

Б) Приготовление экстракта из растительного материала

Нарезают исследуемый материал (картофель, капусту) мелкими кусочками и отвешивают около 10 г материала. Переносят навеску в ступку и тщательно растирают с небольшим количеством кварцевого песка, добавляя небольшими порциями 5 % раствор соляной кислоты до получения жидкой кашицы. С помощью воронки смесь количественно переносят в мерную колбу емкостью 100 мл. Ступку и пестик тщательно обмывают 5 % раствором хлороводородной кислоты, которую сливают в ту же мерную колбу. Всего затрачивают 50 мл 5 % раствора хлороводородной кислоты (конечная ее концентрация в растворе равна 2,5 %).

Содержимое мерной колбы тщательно перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой. После этого фильтруют через складчатый фильтр или центрифугируют. Полученный экстракт должен быть совершенно прозрачным.

В) Определение содержания аскорбиновой кислоты в растительном материале

 

В две конические колбочки на 50 мл приливают по 10 мл полученного растительного экстракта. В одной из проб разрушают витамин С путем добавления нескольких капель пероксида водорода и кипяче­ния. Содержимое колб титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофе­нола (три повторности). При наличии витамина С раствор обесцвечивается, а при дальней­шем прибавлении индикатора раствор окрашивается в розовый цвет. В пробе, где витамин С был разрушен, обесцвечи­вание не происходит, и даже от 1-2 капель индикатора появляется розовое окрашивание.

Расчет содержания аскорбиновой кислоты (Р) в исследуемом материале производится по следующей формуле:

 

Р = 100 · а · V · T / m · n,

где а – затраченный объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола при титровании, мл;

V – объем экстракта (100 мл);

T – титр 2,6-дихлорфенолиндофенол в мг аскорбиновой кислоты;

m – навеска исследуемого материала, г;

n – объем титруемого раствора (10 мл).

В результате находят количество витамина С в мг на 100 г исследуемого продукта. По данному методу определяется только восстановленная форма аскорбиновой кислоты.

Лабораторная работа № 5