Неконкурентные эффекторы ГАМК.

Как уже отмечалось, ГАМК-зависимая мембрана представляет собой сложный по топологии мембранный блок, внешними структурными элементами которого являются: непосредственные биомишени ГАМК (γР) и аллостерически связанные с ними сайты конвульсантов и депрессантов. Биологический смысл эффектирования биомишеней ГАМК (γР) состоит в фиксации той или иной структурной модификации связанных с ними топологических элементов МСП, что в свою очередь определяет формирование режима функционирования концевого топологического элемента ГАМК_А-зависимого мембранного блока - хлор-ионофора (ХИФ). Подобное влияние, распространяемое по последовательно связанной системе γР—МСП— ХИФ. не обязательно должно начинаться с первичного элемента системы (то есть, с γР). а может быть опосредовано эффектированием промежуточных элементов, то есть, структурных составляющих ГАМК_А-РКК (см. 2.6.1). Эффекторы такого типа являются неконкурентными с ГАМК.

Такими неконкурентными в отношении к ГAMК эффекторами ГАМК-зависимой мембраны являются, в частности, эффекторы участков связывания бензодиазепинов, барбитуратов и пикротоксина.

Выраженной депрессантной активностью характеризуются различные алкил- и арилбарбитураты, 5-арилзамещенные бенз-1,4-диазепины (БЗД). Алкил- и арилбарбитураты используются в качестве снотворных средств и средств неингаляционного наркоза, то есть в тех случаях, когда требуется контролируемое депрессантное действие. Первыми такими препаратами, нашедшими применение в медицинской практике, явились «Барбитал» («Веронал») и его натриевая соль «Мединал». Впоследствии в качестве снотворных средств стали использовать «Барбамил», «Нембутал», «Фенобарбитал» и др. Эти соединения оказывают успокаивающее, снотворное и противосудорожное действие, за счёт понижения возбудимости ЦНС (см. 6.1). Установлено, что барбитураты эффектируют свой участок связывания ГАМК_А-РКК (а также пуриновые рецепторы мембран многих клеток).

5-арилзамещенные бенз-1.4-диазепины (БЗД) получили массовое коммерческое распространение в качестве «малых транквилизаторов». К настоящему времени синтезировано и исследовано более 2000 БЗД.

Пролонгированный характер транквилизирующей активности БЗД явился основанием для широкого их использования в психоневрологической клинике (бессонница, тревожно-фобические состояния, раздражительность, алкогольная абстиненция и пр.), а также в качестве противосудорожных и профилактических средств.

Замена арильного заместителя в положении 5 молекулы бенз-1,4-диазепина на алкильный, приводит к «обращению» активности. Так, синтезированный в 1980 г. 5-метил-7-хлор-2-оксибенз-1,4-диазенин (Ro -53663 - шифр британского военно-химического центра Портон-Дауна) является не депрессантом, а конвульсантом. Такое обращение активности связано с резким изменением электронного распределения в молекулах БЗД и Ro -53663, что наглядно иллюстрируется дислокацией реакционных центров с энергиями высших занятых и низших свободных молекулярных орбиталей (соответственно ВЗМО и НСМО):

 

 

 

Подобное трехцентровое сосредоточение как электронной плотности, так и ее дефицита характерно также для молекул метааминофениларилтетразолов (APT) и эндогенного b-карболина (КРБ):

 

 

 

Антидепрессантная активность присуща также производным 6-оксипуринам (таким, как гипоксантин, ксантин и их N-алкильные производные). К их числу относятся теофиллин (1,3-диметилксантин), теобромин (3,7-диметилксантин) и кофеин (1,3,7-триметилксантин) и др. При передозировке этими препаратами антидепрессантная активность усиливается, трансформируясь в конвульсивную активность.

Неконкурентный антагонизм к ГАМК проявляют и эффекторы, блокирующие завершающие внешние топологические элементы ГАМК-зависимой мембраны хлор-ионофоры (ХИФ). Эндогенные соединения подобного рода неизвестны. Экзогенные же блокаторы ХИФ, нарушая механизм хлор-ионной проницаемости мембран тормозных нейронов, проявляют свойства антидепрессантов, то есть конвульсантов.

Большинство из них образуют группу так называемых «cage convulsants» (Casida J.E. et al. 1988), то есть «конвульсантов клеточной структуры», характеризующихся присутствием в молекуле жесткого гетероцикла. К ним относятся:

- бициклические ортоэфиры кислот фосфора;

- бициклические эфиры карбоновых кислот;

- адамантановые и атрановые соединения (дисульфатетраазаадамантан, силатраны и т.д.);

- лактоны (пикротоксинин. шикимин и др.);

- полихлорированные инсектициды (полихлорциклоалканы), структурные особенности которых обусловлены наличием либо циклогексанового (линдан и его изомеры), либо бициклогептанового фрагмента (инсектициды «диенового синтеза» типа альдрина);

- соединения норборнановой структуры (норборнан), пиретроиды, треморогенные микотоксины и т.д. Структурные формулы некоторых из них приведены на рис.3.5.

Рис. 3.5. Структура некоторых конвульсантов «клеточной структуры» блокаторов ГАМК-зависимых хлор-ионных каналов

 

Блокаторы хлор-ионофора объединяют ряд общих свойств: антагонизм в отношении электрофизиологических эффектов ГАМК на мембране; способность к связыванию специфических лигандов хлоринофора (³Н-ТВОВ и ³⁵S-TBPS): ингибирование ГАМК-индуцированного захвата радиоактивного хлора; выраженная судорожная активность и острая токсичность.

Подобные эффекторы хлор-ионофоров были выявлены прежде всего среди ядов природного происхождения, из которых исторически первым обследовался пикротоксин (эквимольная смесь пикротоксинина и пикротина), выделенный из ягод многолетних травянистых растений семейства луносемянниковых (Menispermaceae). Каждый из этих компонентов при введении в организм млекопитающих вызывал судорожную реакцию, которой предшествовали определённые вегетативные расстройства (тахипноэ, саливация, мидриаз, рвота, гипертензия) и повышенная чувствительность на внешние раздражители. Позднее было установлено, что пикротоксинин, как конвульсант активнее пикротина почти в 50 раз: токсодозы при внутрибрюшинном введении (б.мыши) составляют соответственно: конвульсивные (DC₅₀) = 1.5 мг/кг и 80 мг/кг; летальные (DL₅₀) = 3,0 мг/кг и 135 мг/кг.

Наиболее подробно исследован пикротоксинин. В опытах in vivo (кошки, внутриартериально) было показано, что устойчивая гиперполяризация мембран тормозных нейронов ЦНС, вызываемая ГАМК (50-400 мг/кг), через несколько минут после введения пикротоксинина (1-2 мг/кг) обращалась в деполяризацию.

Пикротоксиноподобной конвульсивной активностью характеризуются и ряд структурных аналогов пикротоксинина (рис.3.6.), выделенных из растительного сырья: тутин (DC₅₀ = 1.5 мг/кг, DL₅₀ = 3,0 мг/кг б.мыши, внутрибрюшинно); кориамертин (DC₅₀ = 1.6 мг/кг; DL₅₀ = 3,0 мг/кг, б.мыши внутрибрюшинно); мелитоксин (DC₅₀ = 7,5 мг/кг; DL₅₀ = 15.0 мг/кг. б.мыши внутрибрюшинно).

Исследование взаимосвязи между структурой, конвульсивной активностью и токсичностью перечисленных соединений позволило установить, что их физиологическая активность обусловлена прежде всего сложноэфирным (лактоновым) мостиком - СЗ-С5 в цис-положении к базовому скелету и незамещённой гидроксильной группой при шестом атоме углерода. Оптимальным заместителем при С4 является изопропенильная группа в транс-положении к лактону СЗ-С5 и в цис-положении к гидроксилу при С6. Доказано наличие стабилизирующего взаимодействия между протоном этой группы и π-электронами изопропенильной группы. Отмечена значимость гидрофобности заместителей при С4 с одновременным сохранением их способности фиксировать протон гидроксила при С6. Модификация остальной части молекулы пикротоксинина практически не влияет на активность; пикротоксинин, тутин, кориаметрин, как было отмечено выше, - эквитоксичны.

При рассмотрении механизма действия пикротоксинина и его структурных аналогов с позиции существа рецептор-эффекторного взаимодействия выявлен токсофорный фрагмент молекул этих конвульсантов. Используя методологию расчёта атом-атомных потенциальных функций, было установлено, что энергетически оптимальные конформации молекул всех упомянутых конвульсантов подобны друг другу и представляют собой жёсткие «клеточные» структуры. В такой конформации все электродонорные атомы кислорода (кроме одного в мелитоксине) сосредоточены в одном регионе, составляя как бы единое «электродонорное поле», проекция которого на условную плоскость имеет строго очерченные границы (рис. 3.6).

Рис. 3.6. Структурные аналоги пикротоксина. Конформации молекулы
пикротоксина и его проекция «электронодонорного поля».

Основываясь на подобных представлениях, было выдвинуто предположение, что эффектирование пикротоксинином (и его структурными аналогами) поверхности устья хлор-ионофора описывается как многоточечное донорно-акцепторное взаимодействие. При этом обязательным условием проявления «пикротоксининовой» активности является наличие жёсткой «клеточной» молекулярной структуры, сформированной с участием электродонарных атомов и группировок типа эфирных (эпоксидных) и лактонных. а также структурных фрагментов, ответственных за оптимальную гидрофобность молекул, необходимую для преодоления ГЭБ.

Высказанные представления о токсофорности пикротоксинина удовлетворительно согласуются с выявленными позднее фактами конвульсивной и летальной активности других конвульсантов природного происхождения (шикимина, кунаниола, цикутоксина и пр.), а также синтетических соединений «клеточной структуры» (пентаметилентетразола, дисульфатетраазаадамантана, фенилсилатрана, бициклофосфатов, норборнанов и пр.). Проведённые квантово-химические расчёты показали, что молекулы рассматриваемых структурных типов характеризуются ярко выраженным дипольным моментом. Их конвульсивная активность обусловлена принципиально общим механизмом действия - блокадой хлор-ионной проводимости мембран путём электростатического связывания дипольных составляющих внешней поверхности устья хлор-ионного канала.

Не вдаваясь в особенности анализа связи «структура-активность» для различных типов «клеточных конвульсантов», заметим лишь, что большинство из них имеют электроотрицательную анионоподобную группировку. Например: фрагменты фосфорной, фосфористой, тиофосфорной (бициклофосфаты); ортокарбоновой, ортокремниевой (силатраны); серной (дисульфатетраазаадамантан, эндосульфан). Заместители у атомов базовой структуры оказывают сильное модулирующее влияние на гидрофобное взаимодействие молекул с рецептором и, по всей видимости, играют роль xaoтропных агентов.

Конечно, это не означает, что все соединения рассмотренных структурных типов эффектируют одну и ту же структурную составляющую поверхности устья хлор-ионофора; скорее всего, рецепция осуществляется различными топологическими элементами хлор-ионофоров мембран нейрональных клеток.

Характерно, что токсичность конвульсантов «клеточной структуры» коррелирует с их способностью тормозить специфическое связывание радиоактивно меченых антагонистов ГАМК_А-РКК с рецепторами-мишенями и подавлять индуцируемый ГАМК захват хлора.

Конвульсанты «клеточной структуры» классифицируют на три типа:

-А. Высокоактивные конвульсанты с небольшими заместителями (такие как ортоэфиры кислот фосфора, карбоновых кислот, тетрамины);

-Б. Высокоактивные конвульсанты с объемными заместителями, не нарушающими симметрию молекулы (такие как арилсилатраны, ортоэфиры замещенных карбоновых кислот и т.д.);

-В. Малоактивные бициклические ортоэфиры карбоновых кислот с заместителями, нарушающими симметрию молекулы.

Участком связывания для соединений типа «А», является устье хлор-ионного канала, для соединений типа «Б»- структуры, образованные в результате взаимодействия субъединиц ГАМК_А-РКК и липидов мембраны.

Таким образом, предполагается возможность взаимодействия блокаторов ХИК как со специфическим участком связывания внутри канала с последующей его закупоркой, так и с участком связывания вблизи канала и дальнейшими конформационными изменениями постсинаптической мембраны, сопровождающимися нарушением кинетики ионофора. Считается, что даже для сходных по химической структуре соединений имеет место гетерогенность участков связывания.

В обзорах, обобщающих данные по биологической активности непрямых ГАМК-антагонистов (И.В. Мартынов, В.И. Фетисов, В.Б. Соколов «Бициклические ортоэфиры кислот фосфора» 1989; А.И. Головко, С.И. Головко. С.Ю Зефиров, Г.А. Софронов «Токсикология ГАМК-литиков»1996) подчеркивается, что наиболее токсичными синтетическими блокаторами хлорионофоров являются трет-бутил-БЦФ-ат (DL.₅₀ б.м.= 0,038 мг/кг); трет-бутил-цианофенил (DL₅₀ б.м.=0,06 мг/кг) и экзо-цис-5,6-дихлор,-2,2-дициано-3.3 -бис(трифторметил), иначе называемый «бициклогептан» или «норборнан» (DL₅₀собаки=0,045 мг/кг).

Бициклогептан (БЦГ) в наномолярных концентрациях способен угнетать стимулируемый ГАМК захват радиоактивного хлора и тормозить специфическое связывание ³⁵S-TBPS и ТВОВ; по степени аффинности к белку ионофора значительно превосходит трет-БЦФ-ат, ДСТА, пикротоксин (IC.₅₀ соответственно 46.72.700 и 5000 нМ).

Токсическое действие данных соединений проявляется клонико-тоническими судорогами в экспериментах на различных видах ЛЖ. Для бициклофосфатов и бициклоортобензоатов характерно стремительное развитие интоксикации и гибель в течение 1-30 минут, для БЦГ, - отсроченное развитие симптоматики и гибель в течение нескольких суток. Отличаясь высоким сродством к специфическому участку связывания хлорионофора, БЦГ вызывает развитие судорожных пароксизмов при блокаде не менее половины хлор-ионных каналов ЦНС. При этом отмечается преимущественное ингибирование ХИК ГАМК_А-РКК в стриатуме и мозжечке, в то время как во фронтальной коре плотность хлор-ионофоров остается в пределах исходных показателей.

Профилактика и купирование судорожного синдрома «конвульсантами клеточной структуры» связаны с определенными трудностями (Головко А.И., Головко С.И. с соавт. 1996).

Проведенные биохимические и радиолигандные исследования БЦФ-атов и БЦГ выявили общность их механизма действия, что позволяет отнести их к непрямым антагонистам ГАМК_А-РКК. Данные соединения, так же как и пикротоксинин, линдан, в период судорожной активности вызывают значительное снижение уровня ц-АМФ и увеличение уровня ц-ГМФ в мозжечке. В то же время. БЦГ, в отличие от БЦФ-атов, ДСТА. пикротоксина, является необратимым селективным ингибитором ХИК ГАМК_А-РКК. Наряду с БЦГ. необратимыми ингибиторами ХИК ГАМК_А-РКК являются также пара- и меча- изотиоцианатные аналоги третбутилбициклоортобензоата и фотоафинные лиганды хлорионофора триоксабициклооктановой структуры