Механизмы соединения антитела с антигеном и реакции иммунитета. Виды антител. Моноклональные антитела: принципиальная схема получения, преимущество и практическое применение.

Динамика образования антител. Синтез антител протекает в две фазы. Первая - индуктивная, которая длится 3-5 суток от момен­та введения антигена до появления антител в крови. Вторая - продук­тивная, когда антитела появляются в крови, количество их нарастает к 15-30 суткам и затем снижается. Иммунный ответ после первого вве­дения антигена называют первичным. Особенностью его является то, что первоначально синтезируются IgM, затем IgG.

Вторичный иммунный ответ развивается при повторном введе­нии того же антигена и отличается от первичного следующими особенностями, индуктивная фаза короче (1-2 суток), уровень анти­тел нарастает быстрее, достигает более высоких значений и сохраняется дольше, медленно снижаясь в течение нескольких лет При вторичном иммунном ответе с самого начала образуются IgG. Более быстрая и сильная выработка антител при вторичном иммун­ном ответе объясняется тем, что после первичного введения в орга­низме остаются "клетки памяти", которые при вторичном введении того же антигена быстро размножаются и интенсивно включают про­цесс образования антител.

В практической медицине учитываются особенности динамики антителообразования:

1) при составлении рациональных графиков вакцинации с опреде­ленными интервалами;

2) при экстренной профилактике столбняка людям, получившим травму, если они были ранее привиты столбнячным анатоксином, вво­дят не антитоксическую сыворотку, которая может дать нежелатель­ные аллергические реакции, а анатоксин, - в расчете на быстрый и сильный иммунный ответ;

3) при серологической диагностике дифференцируют первичное заболевание сыпным тифом от рецидива (болезни Брилля) по наличию в крови больного IgM.

Виды антител. Принято различать полные и неполные антитела. Полные антитела имеют не менее двух активных центров, поэтому при постановке реакции агглютинации, преципитации и других реакций иммунитета они обусловливают видимый эффект. Неполные антитела способны соединяться с антигеном, но видимой реакции агглютина­ции или преципитации не наблюдается. Причина в том, что неполные антитела имеют только один активный центр, способный соединяться с антигеном (второй блокирован). Неполными являются антитела к резус-антигену эритроцитов. При многих инфекциях они появляются

наряду с полными антителами. Для выявления неполных антител ис­пользуют реакцию Кумбса.

По характеру действия антитела разделяют на антимикробные, антитоксические, вируснейтрализующие, гемолизины, аутоантитела и др. Антимикробные антитела вызывают агглютинацию бактерий или преципитацию антигенов, извлеченных из них, лизис бактерий при уча­стии комплемента, усиление фагоцитоза - опсонизацию; антитоксины нейтрализуют токсины; вируснейтрализующие антитела оказывают противовирусное действие. Аутоантитела вырабатываются орга­низмом против собственных белков и клеток при изменении их хими­ческой структуры или при освобождении антигенов из разрушивших­ся органов и тканей, или при утрате естественной нммунологической толерантности к каким-то собственным антигенам.

Моноклональные антитела. При введении антигена в иммунный от­вет вовлекается множество лимфоцитов. Они могут различаться между собой по специфичности, различия эти могут быть совсем незначитель­ными. Однако при иммунизации даже таким антигеном, который со­держит одну детерминантную группу, образуются антитела, различа­ющиеся по своей специфичности.

Для получения антител одной специфичности необходимо полу­чить потомство-клон (греч. klon - отпрыск, ветвь) из одного лимфоцита. Но культуру лимфоцитов в искусственной питательной среде получить трудно (вследствие ограниченного числа делений и времени жизни клетки). Только опухолевые клетки могут культивироваться in vitro без ограничения при условии поступления питательных веществ.

Задачу получения культуры клеток, полученных из одного лимфоцита и способных длительно размножаться в питательной сре­де, решили Г.Келер и К. Мильштейн (1975 г., Нобелевская премия, 1984 г.). Авторы разработали методику получения гибридом (гиб­ридных клеток) от слияния лимфоцитов иммунизированных живот­ных с миеломными (опухолевыми) клетками. Слияние осуществляет­ся с помощью полиэтиленгликоля или электрического разряда. По­лученные гибридомы наследуют от лимфоцита способность синте­зировать специфическое антитело, а от миеломной клетки спо­собность бесконечно размножаться в питательной среде in vitro. Син­тезируемые гибридомами антитела могут быть получены в неогра­ниченном количестве. Антитела идентичны и по специфичности, и по классу иммуноглобулинов. Таким образом, полученный in vitro препарат может служить идеальным по специфичности средством для диагностики и лечения (рис. 19).

71. Основные группы серологических реакций. Характеристика реакций для прямого определения антител и антигенов, реакции пассивной агглютинации, методов с применением меченых антител и антигенов.

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютинации. Эту реакцию также используют в двух направлениях.

1) Для обнаружения антител в сыворотке крови больного приме­няются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорби­рован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отноше­нии этой реакции чаще употребляют термин РПГА.

Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых план­шетов и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положитель­ной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде "кру­жевного зонтика», при отрицательной реакции - плотный осадок эрит­роцитов в виде "пуговки".

2) Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исс­ледуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагнос­тикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В от­ношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген па­лочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.

Реакции с участием меченых антигенов или антител основаны на использовании меченых иммунореагентов. Помечены могут быть антигены, антитела или антиглобулиновая сы­воротка. В качестве метки используют флюоресцентные красители (РИФ), ферменты (ИФА), радиоизотопы (РИА), электронноплотные со­единения (ИЭМ).

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакция Кунса. Это метод экспресс-диагностики. Для постановки РИФ применяются иммунные сыворотки, меченные флюорохромными красителями, например, изоти-оцианатом флюоресцеина. Флюорохромы вступают в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их специфичности.

Прямой метод РИФ. Из исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена (например, холерного вибриона), гото­вят препарат-мазок и обрабатывают его флюоресцирующей сыворот­кой, содержащей антитела к данному антигену (в нашем случае - про­тивохолерной сывороткой). При микроскопии в люминесцентном мик­роскопе наблюдают светящиеся микробы.

Недостатком прямого метода РИФ является необходимость иметь боль­шой набор флюоресцирующих сывороток против каждого антигена.

Непрямой метод РИФ. Препарат-мазок обрабатывают иммунной кроличьей антисывороткой к антигену (противохолерной кроличьей сывороткой), а затем - флюоресцирующей антиглобулиновой сыворот­кой, содержащей антитела против глобулинов кролика. Затем наблю­дают в люминесцентном микроскопе светящиеся микробы.

При использовании этого метода можно иметь одну флюоресци­рующую сыворотку против глобулинов кролика.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Как и другие реакции иммуни­тета, ИФА используется 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворот­ке крови больного с помощью известного антигена. Особенность реак­ции в том, что известный ингредиент реакции соединен с ферментом, и его присутствие определяется с помощью субстрата, который при дей­ствии фермента окрашивается.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА.

1) Обнаружение ан­тигена (рис. 20). Первый этап - адсорбция специ­фических антител на твердой фазе, в качестве которой используют по­листироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пла­стиковых панелей.

Второй этап - добав­ление исследуемого ма­териала, в котором пред­полагается наличие ан­тигена. Антиген связы­вается с антителами. После этого луночки промывают.

Третий этап - добав­ление специфической сы­воротки, содержащей антитела против данно­го антигена, меченые ферментом. В качестве

фермента используют пероксидазу или щелочную фосфатазу. Мече­ные антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом ма­териале антигена на поверхности твердой фазы образуется комплекс антитело-антнген-антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилдиамин в смеси с Н2О2 в буферном растворе. При действии фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску, ин­тенсивность которой позволяет количественно определить результаты опыта фотометрированием.

2) Обнаружение антител. Первый этап - адсорбция специ­фических антигенов на стенках лунки. Обычно в коммерческих систе­мах антигены уже адсорбированы на поверхности твердой фазы - в лунках или на пластиковых шариках.

Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитела.

Третий этап - после отмывания лунок добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против глобулинов человека), меченные ферментом.

Результаты реакции учитывают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положи­тельные и заведомо отрицательные.

Разрабатываются "безреагентные" системы для ИФА, в которых все компоненты реакции со­единены с поверхностью полимера. Для проведе­ния анализа необходимо внести исследуемый мате­риал и наблюдать измене­ние окраски.

ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в час­тности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепати­тах.

Иммуноблоттинг - это вариант ИФА, сочетание электрофореза и ИФА.

72. Реакция нейтрализации токсина антитоксином; механизмы и ингредиенты (получение токсина и антитоксической сыворотки, единицы измерения). Применение для определения уровня антитоксического иммунитета (название реакции, постановка), применение с диагностической целью (на примере диагностики ботулизма или столбняка).

В этой реакции антигеном является экзотоксин, антителами - анти­токсины. При их взаимодействии происходит нейтрализация токсина. Реакцию ставят в пробирках для определения силы антитоксической сыворотки. Внешнее проявление реакции - флоккуляция (помутнение). Для обнаружения токсина с диагностической целью при ботулизме, столбняке, газовой анаэробной инфекции ставят реакцию нейтрали­зации токсина антитоксином в биологическом опыте на животных.

Реакции нейтрализации (РН) основаны на способности AT связывать различные возбудители и их метаболиты, лишая тем самым их возможности реализовать свои биологические свойства (ины­ми словами, AT нейтрализуют возбудителей). На практике РН применяют для выявления вирусов и различных токсинов. В определённой степени к ним же относят реакции торможения вирусиндуцированной гемагглютинации и иммобилизации.

РН вирусов. В сыворотке крови переболевших лиц циркулируют AT, нейтрализующие вирусы. Их наличие выявляют смешиванием культуры возбудителя с сывороткой с последующим введением лабораторному животному или заражением культуры клеток. На эффективность нейтрализации указывает выживание животного либо отсутствие гибели клеток в культурах.

РН токсинов применяется для идентификации бактериальных экзотоксинов по видовой и типовой их принадлежности, а также для определения содержания антитоксинов в исследуемой сыворотке. Принцип основан на способности антитоксинов связывать токсин и блокировать его действие. Для идентификации токсина и определения титра антитоксических АТ их смесь вводят лабораторным животным. При соответствии типа токсина и антисывороткии гибели животных не наблюдают. Нейтрализацию токсинов in vitro определяют в реакции флоккуляции. Для определения антитоксического иммунитета у человека часто применяют кожные пробы (например, пробу Шика).