Методы микроскопии; с иммерсионным объективом, в темном поле, фазово – контрастная, люминесцентная микроскопия. Электронный микроскоп.

Методы микроскопического исследования используют для изуче­ния формы и структуры клетки, подвижности микробов.

Микроскопия в световом оптическом микроскопе

Световой микроскоп состоит из механической и оптической час­ти. Механическая часть микроскопа - это штатив, состоящий из осно­вания и колонки, к которой прикреплены тубус и предметный столик. В колонке имеются две винтовые системы для установки тубуса. Макрометрический винт служит для установки на фокус при слабых уве­личениях (объектив х8), а при сильных объективах (х40, х90) - доя первоначальной, грубой установки. Для более точной установки слу­жит микрометрический винт. Это одна из наиболее хрупких частей микроскопа, и работа с ним требует особой осторожности.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппарата, объективов и окуляров.

Осветительный аппарат расположен под предметным столиком. В большинстве микроскопов свет отражается от зеркала и, пройдя через линзы конденсора, фокусируется в плоскости препарата. В сов­ременных микроскопах освещение достигается с помощью вмонтиро­ванного в микроскоп источника света.

Объективы представляют собой систему линз в металлической оп­раве. Передняя (фронтальная) линза - самая маленькая. От нее глав­ным образом зависит увеличение микроскопа. Расположенные за ней линзы называются коррекционными, так как они предназначены для устранения недостатков оптического изображения.

На оправе объективов обозначается создаваемое ими увеличение: х8, х40, х90. Объективы х 8 (малое увеличение) и х40 - это сухие объективы. При работе с ними между фронтальной линзой объектива и препаратом находится воздух. При этом, вследствие разницы пока­зателей преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0), часть световых лу­чей, проходя через оптически неоднородные среды, рассеивается. При микроскопии с объективами х 8 и х 40 это не имеет значения. Но мик­робы настолько малы, что для их исследования необходимо более силь­ное увеличение, которое дает объектив х90. При работе с этим объек­тивом рассеивание света должно быть устранено. Для этого между пред­метным стеклом и линзой помещают каплю жидкости, показатель пре­ломления которой равен показателю преломления стекла. Более всего для этого подходит кедровое масло или его заменители. При микро­скопии объектив погружают в каплю масла, поэтому объектив назы­вают иммерсионным (лат. immercio - погружение), а масло - иммерси­онным маслом. Иммерсионный объектив требует особо осторожного обращения. Фронтальная линза имеет настолько короткое фокусное расстояние до исследуемого объекта, что опускать объектив нужно медленно, глядя сбоку, чтобы не раздавить препарат, что связано с порчей линзы.

Окуляры имеют две линзы: верхняя называется глазной г нижняя -собирательной. Окуляры обозначают по тому увеличению, которое они дают, например: х7, х10, х15. Окуляр дает увеличение, ничего не до­бавляя в деталях изображения, данного объективом.

Чтобы определить общее увеличение микроскопа, нужно умножить увеличение объектива на увеличение окуляра.

Разрешающая способность светового микроскопа - это наимень­шее расстояние между точками в препарате, которые еще не слива­ются в одно изображение. Для светового микроскопа эта способность зависит от длины волны видимого света, и предел разрешения опти­ческого микроскопа равен 0,2 мкм.

Изображение объекта в микроскопе увеличенное и обратное.

Правила микроскопии с иммерсионной системой

1.Работать сидя.

2.Поднять конденсор до уровня предметного столика.

3.Глядя на верхнюю поверхность конденсора, осветить поле зрения.

4.Установить иммерсионный объектив.

5.На предметный столик поместить препарат с каплей Иммерсион­ного масла.

6.Глядя сбоку, осторожно опустить тубус с помощью макровинта до соприкосновения объектива с маслом и чуть-чуть погрузить его в мас­ло, не доводя до соприкосновения с предметным стеклом.

7.Глядя в окуляр, медленно поднимать макровинтом тубус до по­лучения изображения в поле зрения. Не разрешается опускать макровинтом тубус, глядя в окуляр.

8.Микровинтом, вращая его не более чем вполоборота, найти ясное изображение и рассматривать его. 9.Держать оба глаза открытыми. Ле­вой рукой передвигать препарат для общего обозрения. Если предметный столик подвижный - можно для более мелких и точных движений пользоваться боковыми винтами. Правой рукой слегка вращать мик­ровинт, чтобы препарат всегда был в фокусе.

10.После просмотра препарата поднять тубус при помощи макро­винта, снять препарат, установить объектив х8, вытереть мягкой сал­феткой масло с иммерсионного объектива.

Микроскопия в темном поле. Для микроскопии в темном поле при­меняются особые конденсоры, у которых центральная часть линзы за­темнена, за исключением узкой полоски по периферии. Кроме того, боковые поверхности конденсора представляют собой не прямую ли­нию, а параболу. Внутренняя поверхность такого темнопольного па­раболоид-конденсора зеркальная. Лучи света попадают в темнопольный конденсор только через узкую полоску по периферии линзы. За­тем они отражаются от его зеркальной поверхности и, если в поле зре­ния нет никакого объекта, то ни один луч не попадает в объектив. Поле зрения кажется совершенно черным. Если же в поле зрения есть какие-то объекты, например, микробы, то лучи, отраженные от них, попада­ют в объектив, и их можно видеть светящимися на темном фоне.

Это явление подобно тому, которое наблюдается в комнате с за­темненными окнами, когда в косых лучах света, проникающих через щель, видны танцующие пылинки, при обычном освещении невидимые (феномен Тиндаля).

За неимением специального темнопольного конденсора можно обычный конденсор превратить в темнопольный, поместив между его линзами кружок черной бумаги, немногим меньше по диаметру линзы конденсора. В таком "приспособленном" конденсоре можно наблю­дать достаточно ясно живых светящихся микробов, но поле зрения бу­дет не черным, а серым.

Преимущество микроскопии в темном поле зрения состоит в том, что при этом можно видеть объекты более мелкие. Кроме того, в тем­ном поле зрения лучше наблюдать в живом состоянии такие микробы, как лептоспиры, которые в водной среде не преломляют света и поэто­му в проходящем свете совершенно прозрачны.

Фазовоконтрастная микроскопия. При прохождении через непроз­рачные объекты, такие как окрашенные препараты микроорганизмов, амплитуда световых волн уменьшается. Такие изменения, называемые амплитудными, улавливаются человеческим глазом. Поэтому ок­рашенные микробы видны в обычном микроскопе.

Объекты, разные по плотности, но одинаковые по прозрачности, не меняют амплитуды световых волн, а только изменяют фазу. Такие фазовые изменения человеческий глаз не способен уловить. Поэтому живые клетки микробов, их структурные элементы в живом состоянии прозрачны в проходящем свете и для нас невидимы.

Фазовоконтрастный микроскоп превращает фазовые изменения в амплитудные. Поэтому структурные элементы с различной плотнос­тью выглядят как более светлые и более темные. Это позволяет наблю­дать не только фазовые объекты целиком, но и структурные элементы микробов.

Фазовоконтрастная микроскопия осуществляется с помощью обыч­ного светового микроскопа, в котором заменяют объективы и конден­сор на специальные - фазово-контрастные.

Люминесцентная микроскопия. Люминесценция - это свечение объек­та за счет поглощенной световой энергии коротковолновой или ульт­рафиолетовой части спектра. Большинство микроорганизмов не обла­дает собственной люминесценцией, поэтому пользуются наведенной люминесценцией путем обработки микробов флюорохромами. Чаще всего используют акридин-оранж, аурамин, изоцианат флюоресцеина, которые светятся под влиянием ультрафиолетовых лучей. Некото­рые флюорохромы избирательно связываются с определенными структурами, такими, как ядро, цитоплазма, включения. Таким образом, можно дифференцировать эти структуры. Препараты, обработан­ные флюорохромами, микроскопируют в специальных люминесцент­ных микроскопах, в которых объекты исследуются в ультрафиолето­вых лучах.

Люминесцентная микроскопия используется для реакции иммунофлюоресценции (РИФ). В этой реакции для определения вида мик­робов препарат-мазок из исследуемого материала обрабатывают спе­цифической антисывороткой, соединенной с флюорохромом. Если в материале содержатся микробы, соответствующие антисыворотке, то при микроскопии препарата в люминесцентном микроскопе наблюдается свечение микробов.

Электронная микроскопия. Возможности разрешающей способнос­ти светового микроскопа ограничены не качеством линз, а длиной вол­ны видимого света. В электронном микроскопе вместо световых лучей используется поток электронов. Источником электронов является рас­каленная вольфрамовая нить. Роль линз в электронном микроскопе выполняет круговое магнитное поле. Вначале электроны попадают в магнитный конденсор и сходятся в одной точке на рассматриваемый предмет, лежащий в безвоздушной среде на тонкой пленке коллодия. Затем пучок электронов проходит через объективную и проекционные линзы. Наблюдатель видит не поток электронов, а изображение, которое проецируется на флуоресцирующий экран или фотографическую пленку. Возникновение изображения на экране обусловлено тем, что различные части исследуемого объекта обладают неодинаковой про­ницаемостью для электронов. Электроноплотные участки выглядят тем­ными, электронопрозрачные - светлыми.

С помощью электронного микроскопа можно наблюдать вирусы, детали морфологии микробов. Используя метод иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ), можно видеть и сфотографировать вирусы с при­соединившимися к ним антителами.

Основные принципы систематики бактерий. Таксономические категории. Принципы классификации. Понятие о виде, критерии вида как основной таксономической единице. Подвид, инфравид (биовар, серовар, хемовар, фаговар), культура, популяция, штамм, клон (определение понятий).

Виды, связанные генетическим родством, объединяют в роды, роды — в семейства. Высшими таксономическими категориями являются царства и подцарства.

Согласно современной систематике, патогенные (болезнетворные) бактерии относятся к надцарству прокариотов (Procaryotae), царству эукариот (Eucaryotae), грибы — к царству микота (Mycota), простейшие — к царству Protozoa, вирусы — к царству Vira.

В основе современной систематики микроорганизмов лежат фенотипические признаки: морфологичеческие, физиологические, биохимические. Морфологические характеризуют форму и структуру микробной клетки; фйизиологические — особенности роста микроорганизма на искусственных питательных средах в определенных условиях культивирования (температура, рН и др.), а также морфологию колоний на твердых средах и характер роста на жидкой среде; биохимические — тип окислительного и пластического метаболизма, ферментацию углеводов, протеолитические и другие признаки.

В настоящее время используют ряд таксономических систем: нумерическая таксономия, хемотаксономия, генетическая и серологическая таксономии.

Нумерическая таксономия признает равноценность всех фенотипических признаков. Для ее применения необходимо иметь информацию о многих десятках признаков. Видовая принадлежность исследуемого микроорганизма устанавливается по числу совпадающих признаков. Расчеты проводятся с помощью компьютера. Трудности получения информации о многочисленных признаках исследуемого микроорганизма ограничивает возможность применения нумерической таксономии.

Для хемотаксонамии применяют физико-химические и биохимические методы: газовожидкостная хроматография, электрофорез и другие, с помощью которых исследуют липидный, аминокислотный состав (протеиновые профили) микробной клетки и ее компонентов, напр., клеточной стенки.

Генотаксономия основана на генетических признаках, которые устанавливаются в опытах трансформации, трансдукции и конъюгации, а также анализе внехромосомных факторов наследственности — плазмид, транспозонов и фагов.

Серотаксономия основана на определении соответствующих антигенов, содержащихся в вбактериальной клетки с помощью диагностических сывороток. Данный метод особенно часто применяется в медицинской микробиологии.

- классификация бактерий по источнику питания (аутотрофы и гетеротрофы)

- классификация бактерий по источнику энергии (фототрофы и хемотрофы)

- классификация бактерий по способу углеродного питания (фотолитотрофы, хемолитотрофы, хемоорганотрофы, прототрофы и ауксотрофы)

Вид — совокупность микроорганизмов, имеющих общий корень происхождения и максимально близкие фенотипические признаки и свойства. (Вид — эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющих единый тип организации, который в стандартных условиях проявляется сходными фенотипическими признаками: морфологическими, физиологическими, биохимическими и др.) Однако генетичские механизмы, лежащие в основе изменчивости микроорганизмов, обеспечивают только относительную стабильность перечисленных признаков, которые в пределах одного и того же вида могут варьировать. Отсюда сложившееся понятие о вариантах (варах) микроорганизмов, отличающиеся отдельными признаками от стандартных видов. Так, различают морфовары (отличаются по морфологическим признакам), биовары (по биологическим признакам), ферментовары (по ферментативным признакам), резистенсвары (резистентностью к антибиотикам), фаговары (к фагам), серовары (по антигенной структуре), эковары (по экологическим нишам), патовары (по патогенности).

Домен→царство→ тип→класс→порядок→семейство→род→вид→подвид.

Колония — скопление бактерий одного вида на (или в) плотной питательной среде.

Чистая культура — популяция состоящая из особей одного вида. (из олной микробной клетки на искусственной питательной среде)

Штамм — чистые культуры микробов одного вида, полученные из разных источников или из одного источника в разное время.

Клон — культура микроорганизмов, полученная из одной клетки.

Популяция — совокупность особей одного вида, обитающих в пределах биотопа (территориально ограниченный участок биосферы с относительно однородными условиями жизни).

(В микробиологии широко применяются специальные термины: штамм, клон, чистая культура. Штамм — культура, выделенная из определенного источника, или из одного и того же источника в разное время. Обычно штаммы обозначают либо протокольными номерами, либо по источнику выделения (человек, животное, внешняя среда), либо по местности (городу), где он был выделен. Штаммы одного и того же вида могут быть идентичными или различаться по некоторым признакам, не выходящим за пределы вида. Клоном называют культуру микроорганизма, выделенную из одной клетки (одноклеточная культура). Чистая культура представляет собой микробные особи одного и того же вида, выращенные из изолированной колонии, выращенной на твердой питательной среде.)