Строение и основные свойства клеточных мембран и ионных каналов

Согласно современным представлениям, биологические мембраны образуют наружную оболочку всех животных клеток и формируют многочисленные внутриклеточные органеллы. Наиболее характерным структурным признаком является то, что мембраны всегда образуют замкнутые пространства, и такая микроструктурная организация мембран позволяет им выполнять важнейшие функции.

Строение и функции клеточных мембран.

1.Барьерная функция выражается в том, что мембрана при помощи соответствующих механизмов участвует в создании концентрационных градиентов, препятствуя свободной диффузии. При этом мембрана принимает участие в механизмах электрогенеза. К ним относятся механизмы создания потенциала покоя, генерация потенциала действия, механизмы распространения биоэлектрических импульсов по однородной и неоднородной возбудимым структурам.

2.Регуляторная функция клеточной мембраны заключается в тонкой регуляции внутриклеточного содержимого и внутриклеточных реакций за счет рецепции внеклеточных биологически активных веществ, что приводит к изменению активности ферментных систем мембраны и запуску механизмов вторичных «месенджеров» («посредников»).

3.Преобразование внешних стимулов неэлектрической природы в электрические сигналы (в рецепторах).

4.Высвобождение нейромедиаторов в синаптических окончаниях.

Современными методами электронной микроскопии была определена толщина клеточных мембран (6—12 нм). Химический анализ показал, что мембраны в основном состоят из липидов и белков, количество которых неодинаково у разных типов клеток. Сложность изучения молекулярных механизмов функционирования клеточных мембран обусловлена тем, что при выделении и очистке клеточных мембран нарушается их нормальное функционирование. В настоящее время можно говорить о нескольких видах моделей клеточной мембраны, среди которых наибольшее распространение получила жидкостно-мозаичная модель.

Согласно этой модели, мембрана представлена бислоем фосфолипидных молекул, ориентированных таким образом, что гидрофобные концы молекул находятся внутри бислоя, а гидрофильные на­правлены в водную фазу (рис. 2.1). Такая структура идеально подходит для образования раздела двух фаз: вне- и внутриклеточной.

Рис. 2.1. Трехмерная жидкостно-мозаичная модель клеточной мембраны по Singer-Nikolson. А — фосфолипидный бислой, в котором погружены белки; Б — различные моменты движения ионов Na^+ через натриевый канал.

В фосфолипидном бислое интегрированы глобулярные белки, полярные участки которых образуют гидрофильную поверхность в водной фазе. Эти интегрированные белки выполняют различные функции, в том числе рецепторную, ферментативную, образуют ионные каналы, являются мембранными насосами и переносчиками ионов и молекул.

Некоторые белковые молекулы свободно диффундируют в пло­скости липидного слоя; в обычном состоянии части белковых мо­лекул, выходящие по разные стороны клеточной мембраны, не изменяют своего положения. Здесь описана только общая схема строения клеточной мембраны и для других типов клеточных мем­бран возможны значительные различия.

Электрические характеристики мембран. Особая морфология клеточных мембран определяет их электрические характеристики, среди которых наиболее важными являются емкость и проводимость.

Емкостные свойства в основном определяются фосфолипидным бислоем, который непроницаем для гидратированных ионов и в то же время достаточно тонок (около 5 нм), чтобы обеспечивать эффективное разделение и накопление зарядов и электростатическое взаимодействие катионов и анионов. Кроме того, емкостные свойства клеточных мембран являются одной из причин, определяющих временные характеристики электрических процессов, протекающихщих на клеточных мембранах.

Проводимость (g) — величина, обратная электрическому сопро­тивлению и равная отношению величины общего трансмембранного тока для данного иона к величине, обусловившей его трансмемб­ранной разности потенциалов.

Через фосфолипидный бислой могут диффундировать различные вещества, причем степень проницаемости (Р), т. е. способность кле­точной мембраны пропускать эти вещества, зависит от разности кон­центраций диффундирующего вещества по обе стороны мембраны, его растворимости в липидах и свойств клеточной мембраны. Скорость диффузии для заряженных ионов в условиях постоянного поля в мем­бране определяется подвижностью ионов, толщиной мембраны, рас­пределением ионов в мембране. Для неэлектролитов проницаемость мембраны не влияет на ее проводимость, поскольку неэлектролиты не несут зарядов, т. е. не могут переносить электрический ток.

Проводимость мембраны является мерой ее ионной проницаемо­сти. Увеличение проводимости свидетельствует об увеличении ко­личества ионов, проходящих через мембрану.

Строение и функции ионных каналов. Ионы Na+, K+, Са2+, Сl- проникают внутрь клетки и выходят наружу через специальные, заполненные жидкостью каналы. Размер каналов довольно мал (ди­аметр 0,5—0,7 нм). Расчеты показывают, что суммарная площадь каналов занимает незначительную часть поверхности клеточной мембраны.

Функцию ионных каналов изучают различными способами. На­иболее распространенным является метод фиксации напряжения, или «voltage-clamp» (рис. 2.2). Сущность метода заключается в том, что с помощью специальных электронных систем в процессе опыта изменяют и фиксируют на определенном уровне мембранный по­тенциал. При этом измеряют величину ионного тока, протекающего через мембрану. Если разность потенциалов постоянна, то в соот­ветствии с законом Ома величина тока пропорциональна проводи­мости ионных каналов. В ответ на ступенчатую деполяризацию открываются те или иные каналы, соответствующие ионы входят в клетку по электрохимическому градиенту, т. е. возникает ионный ток, который деполяризует клетку. Это изменение регистрируется с помощью управляющего усилителя и через мембрану пропускается электрический ток, равный по величине, но противоположный по направлению мембранному ионному току. При этом трансмембран­ная разность потенциалов не изменяется. Совместное использование метода фиксации потенциала и специфических блокаторов ионных каналов привело к открытию различных типов ионных каналов в клеточной мембране.

Рис. 2.2. Метод фиксации напряжения «voltage-clamp». I — аксон; 2 — источник переменного потенциала; 3 — блок управления установки потенциала экспериментатором; 4 — усили­тель обратной связи; 5 — система измерения величины тока.

В настоящее время установлены многие типы каналов для раз­личных ионов (табл. 2.1). Одни из них весьма специфичны, вторые, кроме основного иона, могут пропускать и другие ионы.

Изучение функции отдельных каналов возможно методом ло­кальной фиксации потенциала «path-clamp»; рис. 2.3, А). Стеклян­ный микроэлектрод (микропипетка) заполняют солевым раствором, прижимают к поверхности мембраны и создают небольшое разре­жение. При этом часть мембраны подсасывается к микроэлектроду. Если в зоне присасывания оказывается ионный канал, то регист­рируют активность одиночного канала. Система раздражения и ре­гистрации активности канала мало отличается от системы фиксации напряжения.

Таблица 2.1. Важнейшие ионные каналы и ионные токи возбудимых клеток

Тип канала	Функция	Ток	Блокатор канала
Калиевый (в покое)	Генерация потенциала покоя	IK+ (утечка)	ТЭА
Натриевый	Генерация потенциала действия	INa+	ТТХ
Кальциевый	Генерация медленных потенциалов	ICa2+	D-600, верапамил
Калиевый (задержанное выпрямление)	Обеспечение реполяризации	IK+ (задержка)	ТЭА
Калиевый кальций-активируемый	Ограничение деполяризации, обусловленной током Са2+	IK+Ca2+	ТЭА

Примечание. ТЭА — тетраэтиламмоний; ТТХ — тетродотоксин.

Ток через одиночный ионный канал имеет прямоугольную форму и одинаков по амплитуде для каналов различных типов (рис. 2.3, Б). Длительность пребывания канала в открытом состоянии имеет ве­роятностный характер, но зависит от величины мембранного потен­циала. Суммарный ионный ток определяется вероятностью нахож­дения в открытом состоянии в каждый конкретный период времени определенного числа каналов (рис. 2.3, В).

Рис. 2.3. Метод локальной фиксации потенциала «path-clamp». А — схема метода; Б — форма тока, протекающего через одиночный натриевый канал при действии деполяризующего стимула. 1 — ионные каналы и клеточная мембрана; 2 — стеклянный микроэлектрод; 3 — ионный ток через открытый канал; 4 — токи через одиночный натриевый канал; В — суммарный ток через натриевые каналы (по Patlack A. Horn, 1982).

Наружная часть канала сравнительно доступна для изучения, исследование внутренней части представляет значительные трудности. П. Г. Костюком был разработан метод внутриклеточного диа­лиза, который позволяет изучать функцию входных и выходных структур ионных каналов без применения микроэлектродов. Ока­залось, что часть ионного канала, открытая во внеклеточное про­странство, по своим функциональным свойствам отличается от части канала, обращенной во внутриклеточную среду.

Именно ионные каналы обеспечивают два важных свойства мем­браны: селективность и проводимость.

Селективность, или избирательность, канала обеспечивается его особой белковой структурой. Большинство каналов являются электроуправляемыми, т. е. их способность проводить ионы зависит от величины мембранного потенциала. Канал неоднороден по своим функциональным характеристикам, особенно это касается белковых структур, находящихся у входа в канал и у его выхода (так назы­ваемые воротные механизмы).

Рис. 2.4. Работа натриевых каналов и «воротных» механизмов. А — в покое m-активационные ворота («m-ворота») закрыты; Б — при возбуждении «m-ворота» открыты; В — закрытие «n-ворот» (инактивация) при деполяризации.

Рассмотрим принцип работы ионных каналов на примере натри­евого канала. Полагают, что в состоянии покоя натриевый канал закрыт. При деполяризации клеточной мембраны до определенного уровня происходит открытие m-активационных ворот (активация) и усиление поступления ионов Na+ внутрь клетки. Через несколько миллисекунд после открытия m-ворот происходит закрытие п-ворот, расположенных у выхода натриевых каналов (инактивация) (рис. 2.4). Инактивация развивается в клеточной мембране очень быстро и степень инактивации зависит от величины и времени действия деполяризующего стимула.

Работа натриевых каналов определяется величиной мембранного потенциала в соответствии с определенными законами вероятности. Рассчитано, что активированный натриевый канал пропускает всего 6000 ионов за 1 мс. При этом весьма существенный натриевый ток, который проходит через мембраны во время возбуждения, представ­ляет собой сумму тысяч одиночных токов.

При генерации одиночного потенциала действия в толстом нерв­ном волокне изменение концентрации ионов Na+ во внутренней среде составляет всего 1/100000 от внутреннего содержания ионов Na ги­гантского аксона кальмара. Однако для тонких нервных волокон это изменение концентрации может быть весьма существенным.

Кроме натриевых, в клеточных мембранах установлены другие виды каналов, избирательно проницаемых для отдельных ионов: К+, Са2+, причем существуют разновидности каналов для этих ионов (см. табл. 2.1).

Ходжкин и Хаксли сформулировали принцип «независимости» каналов, согласно которому потоки натрия и калия через мембрану независимы друг от друга.

Свойство проводимости различных каналов неодинаково. В ча­стности, для калиевых каналов процесс инактивации, как для на­триевых каналов, не существует. Имеются особые калиевые каналы, активирующиеся при повышении внутриклеточной концентрации кальция и деполяризации клеточной мембраны. Активация калий-кальцийзависимых каналов ускоряет реполяризацию, тем самым восстанавливая исходное значение потенциала покоя.

Особый интерес представляют кальциевые каналы.

Входящий кальциевый ток, как правило, недостаточно велик, чтобы нормально деполяризовать клеточную мембрану. Чаще всего поступающий в клетку кальций выступает в роли «мессенджера», или вторичного посредника. Активация кальциевых каналов обес­печивается деполяризацией клеточной мембраны, например входя­щим натриевым током.

Процесс инактивации кальциевых каналов достаточно сложен. С одной стороны, повышение внутриклеточной концентрации сво­бодного кальция приводит к инактивации кальциевых каналов. С другой стороны, белки цитоплазмы клеток связывают кальций, что позволяет поддерживать длительное время стабильную величину кальциевого тока, хотя и на низком уровне; при этом натриевый ток полностью подавляется. Кальциевые каналы играют существен­ную роль в клетках сердца. Электрогенез кардиомиоцитов рассмат­ривается в главе 7. Электрофизиологические характеристики кле­точных мембран исследуют с помощью специальных методов.

Методы изучения возбудимых клеток

Электрические явления, которые возникают в возбудимых тка­нях, обусловлены электрическими свойствами клеточных мембран. Поэтому необходимо остановиться на методических подходах совре­менной физиологии возбудимых тканей, используемых при иссле­довании электрических характеристик клеточных мембран.

Любая физиологическая установка, предназначенная для изучения возбудимых клеток и тканей, должна содержать следующие основные элементы: 1) электроды для регистрации и стимуляции; 2) усилители биоэлектрических сигналов; 3) реги­стратор; 4) стимулятор; 5) систему для обработки физиологической информации. В зависимости от задач исследования обычно требуется дополнительное оборудование. Поскольку в современной медицине широко используются методы электрофизиоло­гического исследования и воздействия электрическим током, необходимо кратко познакомиться с основными методическими приемами.

При работе на изолированных органах, тканях и отдельных клетках применяют специальные камеры и растворы определенного состава, например Рингера-Локка, Тироде, Хэнкса, позволяющие в течение длительного времени поддерживать нор­мальную жизнедеятельность биологического объекта. Во время эксперимента раствор должен быть насыщен кислородом и иметь соответствующую температуру (для хладнокровных животных +20°С, для теплокровных +37°С). В процессе эксперимента необходимо использовать проточные камеры для непрерывного обновления раствора, в котором находится биологический объект.

При электрофизиологических исследованиях используют различные типы электро­дов, детальное описание которых можно найти в соответствующих руководствах. В то же время есть определенные требования ко всем без исключения электродным системам.

Электроды, которые используют в эксперименте, должны оказывать минимальное влияние на объект исследования, т. е. они должны только передавать информацию от объекта или на объект.

Если в электрофизиологическом эксперименте исследуют собственно процесс возбуждения, то необходимо применять два электрода с различной величиной площади контактной поверхности (желательно в соотношении не менее 1:100), при этом электрод меньшей площади называют активным, или референтным, большей пло­щади — пассивным, или индифферентным. При исследовании процесса распрост­ранения возбуждения необходимо использовать два активиых электрода с одинаковой площадью контактных поверхностей, устанавливаемых на возбудимой ткани на не­котором расстоянии друг от друга, и индифферентный электрод, который устанав­ливается в отдалении. В первом случае говорят о моно-(уни-) полярном способе отведения потенциала (раздражении), во втором — о биполярном способе. Необходимо подчеркнуть, что термин «униполярный» способ весьма условен, поскольку всегда регистрируется разность потенциалов, а не абсолютное значение потенциала.

Поскольку работа с биологическим объектом подразумевает контакт электрода с жидкостью, содержащейся в биологическом объекте, высока вероятность возникно­вения контактных поляризационных потенциалов, которые могут существенно иска­зить результаты исследования. Чтобы избежать возможных искажений в электрофи­зиологических экспериментах, как правило, используют специальные слабополяризующиеся электроды, например хлорсеребряные или каломельные, имеющие незначительный поляризационный потенциал.

При исследовании электрофизиологических характеристик отдельных клеток ис­пользуют стеклянные микроэлектроды. Они представляют собой микропипетку с диаметром кончика менее 0,5 мкм, заполненные ЗМ раствором хлорида калия.

В электрофизиологических экспериментах применяют самые различные усили­тели биологических сигналов, позволяющие измерять минимальные изменения тока (до 10 А) и напряжения (до 10 -7 В) В связи с тем что регистрируемые сигналы могут иметь высокую скорость нарастания переднего фронта, усилители должны иметь достаточно широкую полосу пропускания (сотни кГц). Наибольшие требования предъявляются ко входным каскадам усилителей, которые должны быть согласованы с внутренним сопротивлением измерительного электрода, причем наибольшие труд­ности экспериментатор встречает при использовании микроэлектродов для регистра­ции быстрых изменений тока или потенциала, поскольку микроэлектроды могут иметь очень высокое внутреннее сопротивление (до 150 мОм).

Стимулвторы, регистраторы, системы управления экспериментом и обработки физиологической информации еще более разнообразны и их описание можно найти в специальной литературе.

Рис. 2.5. Внутриклеточная регистрация трансмембранных потенциалов и электростимуляция клеточной мемб­раны. К — схема установки для изучения электрических характеристик клеточных мембран; Б — момент введения микроэлектрода а клетку. 1 — стеклянный микроэлектрод для подачи тока; 2 — стеклянный микроэлектрод для регистрации реакции клеточной мембраны; 3 — электроды сравнения; 4 — измеритель величины раздражающего тока; 5 — усилитель; 6 — регистратор.

На рис. 2.5, А показана схема простейшей установки для из­мерения трансмембранной разности потенциалов и изучения реакций возбудимой мембраны при ее электрической стимуляции.

Исследуемый биообъект (клетка, кусочек ткани) помещен в каме­ру, содержащую солевой раствор и электрод сравнения. Если измери­тельный электрод также находится в растворе, то разность потенциа­лов между ним и электродом сравнения стремится к нулю. В момент проникновения микроэлектрода внутрь клетки регистрируют отрица­тельный потенциал относительно внешней среды (рис. 2.5, Б). Пере­мещение кончика микроэлектрода внутри клетки не приводит к изме­нению измеряемой разности потенциалов, если электрод не повредил клетку. У покоящейся клетки с нормальным метаболизмом и стабиль­ными условиями внешней и внутренней среды постоянная разность потенциалов будет регистрироваться неопределенно долго. Эта посто­янная разность потенциалов называется потенциалом покоя, или мембранным потенциалом покоя. При этом потенциал внеклеточной среды принимается равным нулю. Величина потенциала покоя неоди­накова у различных типов клеток и колеблется обычно от -70 до -95 мВ.

В том случае, если в клетку введен второй, стимулирующий микроэлектрод, можно исследовать реакцию возбудимой мембраны на действие электрического тока. Если стимулирующий электрод электроотрицателен по отношению к внутренней среде клетки, то говорят о входящем токе, при этом общая трансмембранная разность потенциалов увеличивается, т. е. происходит гиперполяризация кле­точной мембраны. Напротив, если стимулирующий электрод элек­троположителен по отношению к внутренней среде клетки, то го­ворят о выходящем токе, при этом общая трансмембранная разность потенциалов уменьшается, т. е. происходит деполяризация клеточ­ной мембраны (рис. 2.6). Как правило, при действии гиперполяризующего тока потенциал мембраны изменяется в соответствии с законом Ома. При этом изменение потенциала не зависит от мо­лекулярных процессов в мембране, поэтому говорят, что изменяются пассивные электрические свойства мембраны. При действии депо­ляризующего тока потенциал мембраны не подчиняется закону Ома, что связано с изменением функциональных характеристик ионных каналов клеточной мембраны. Если деполяризация клеточной мем­браны достигает так называемого критического уровня, происходит активация ионных каналов клеточной мембраны и возникает по­тенциал действия. Критический потенциал (Eкp) — уровень мемб­ранного потенциала, при котором начинается генерация потенциала действия. Потенциал действия (ПД, спайк, импульс) — быстрое колебание мембранного потенциала покоя в положительном направ­лении. В этом случае мембрана реагирует активно, поскольку из­менение трансмембранной разности потенциалов обусловлено изме­нением функциональных свойств ионных каналов.

Детальный анализ процессов, протекающих в мембранах возбу­димых клеток, был проведен Ходжкиным, Хаксли и Катцем в опытах на гигантском аксоне кальмара и привел к созданию современной теории происхождения потенциала покоя и потенциала действия.

Потенциал покоя

Схема опыта Ходжкина—Хаксли приведена на рис. 2.7. В аксон кальмара диаметром около 1 мм, помещенный в морскую воду, вводили активный электрод, второй электрод (электрод сравнения) находился в морской воде. В момент введения электрода внутрь аксона регистрировали скачок отрицательного потенциала, т. е. внутренняя среда аксона была заряжена отрицательно относительно внешней среды.

Рис. 2.7. Опыт Ходжкина—Хаксли на гигантском аксоне кальмара. А — стимуляция аксона электрическим стимулом прямоугольной формы; Б — форма потенциала действия, зарегистрированная в данном опыте. 1 — аксон; 2 — активный электрод; 3 — электрод сравнения; 4 — усилитель. Стрелками показано направление распространения возбуждения.

Как указывалось в разделе 2.1.2, электрический потенциал со­держимого живых клеток принято измерять относительно потенци­ала внешней среды, который обычно принимают равным нулю. Поэтому считают синонимами такие понятия, как трансмембранная разность потенциалов в покое, потенциал покоя, мембранный по­тенциал. Обычно величина потенциала покоя колеблется от -70 до -95 мВ. Согласно концепции Ходжкина и Хаксли, величина потенциала покоя зависит от ряда факторов, в частности от селек­тивной (избирательной) проницаемости клеточной мембраны для различных ионов; различной концентрации ионов цитоплазмы клет­ки и ионов окружающей среды (ионной асимметрии); работы ме­ханизмов активного транспорта ионов. Все эти факторы тесно свя­заны между собой и их разделение имеет определенную условность.

Известно, что в невозбужденном состоянии клеточная мембрана высокопроницаема для ионов калия и малопроницаема для ионов натрия. Это было показано в опытах с использованием изотопов натрия и калия: спустя некоторое время после введения внутрь аксона радиоактивного калия его обнаруживали во внешней среде. Таким образом, происходит пассивный (по градиенту концентраций) выход ионов калия из аксона. Добавление радиоактивного натрия во внешнюю среду приводило к незначительному повышению его концентрации внутри аксона. Пассивный вход натрия внутрь аксона несколько уменьшает величину потенциала покоя.

Установлено, что имеется разность концентраций ионов калия вне и внутри клетки, причем внутри клетки ионов калия примерно в 20—50 раз больше, чем вне клетки (табл. 2.2).

Таблица 2.2. Концентрация ионов снаружи и внутри клетки, ммоль/л

Ионы	Аксон кальмара	Мышечное волокно (лягушка)
внутри клетки	снаружи клетки	внутри клетки	снаружи клетки
к+				2.2
Na+
Сl-			1.5

Разность концентраций ионов калия вне и внутри клетки и высо­кая проницаемость клеточной мембраны для ионов калия обеспечива­ют диффузионный ток этих ионов из клетки наружу и накопление избытка положительных ионов К+ на наружной стороне клеточной мембраны, что противодействует дальнейшему выходу ионов К+ из клетки. Диффузионный ток ионов калия существует до тех пор, пока стремление их двигаться по концентрационному градиенту не уравно­весится разностью потенциалов на мембране. Эта разность потенциа­лов называется калиевым равновесным потенциалом.

Равновесный потенциал (для соответствующего иона, Ек) — разность потенциалов между внутренней средой клетки и внекле­точной жидкостью, при которой вход и выход иона уравновешен (химическая разность потенциалов равна электрической).

Важно подчеркнуть следующие два момента: 1) состояние рав­новесия наступает в результате диффузии лишь очень небольшого количества ионов (по сравнению с их общим содержанием); кали­евый равновесный потенциал всегда больше (по абсолютному зна­чению) реального потенциала покоя, поскольку мембрана в покое не является идеальным изолятором, в частности имеется небольшая утечка ионов Na+. Сопоставление теоретических расчетов с исполь­зованием уравнений постоянного поля Д. Голдмана, формулы Нернста показали хорошее совпадение с экспериментальными данными при изменении вне- и внутриклеточной концентрации К+ (рис. 2.8).

Трансмембранная диффузионная разность потенциалов рассчи­тывается по формуле Нернста:

Ek=(RT/ZF)ln(Ko/Ki)

где Ек — равновесный потенциал, R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, Z — валентность нона, F — постоянная Фарадея, Ко и Ki — концентрации ионов К+ вне и внутри клетки соответственно.

Рис. 2.8. Зависимость величины потенциала покоя от внеклеточной концентрации К+ (расчетная и экспериментальная кривые). По оси абсцисс – содержание калия во внешней среде в мМ, по оси ординат – величина мембранного потенциала в мВ.

Величина мембранного потенциала для значений концентрации ионов К+, приведенных в табл. 2.2, при температуре +20 °С составит примерно —60 мВ. Поскольку концентрация ионов К+ вне клетки меньше, чем внутри, Ек будет отрицательным.

В состоянии покоя клеточная мембрана высокопроницаема не только для ионов К+. У мышечных волокон мембрана высокопро­ницаема для ионов СГ. В клетках с высокой проницаемостью для ионов Сl-, как правило, оба иона (Сl- и К+) практически в одинаковой степени участвуют в создании потенциала покоя.

Известно, что в любой точке электролита количество анионов всегда соответствует количеству катионов (принцип электронейт­ральности), поэтому внутренняя среда клетки в любой точке электронейтральна. Действительно, в опытах Ходжкина, Хаксли и Катца перемещение электрода внутри аксона не выявило различие в транс­мембранной разности потенциалов.

Поскольку мембраны живых клеток в той или иной степени проницаемы для всех ионов, совершенно очевидно, что без специ­альных механизмов невозможно поддерживать постоянную разность концентрации ионов (ионную асимметрию). В клеточных мембранах существуют специальные системы активного транспорта, работаю­щие с затратой энергии и перемещающие ионы против градиента концентраций. Экспериментальным доказательством существования механизмов активного транспорта служат результаты опытов, в которых активность АТФазы подавляли различными способами, на­пример сердечным гликозидом оуабаином. При этом происходило выравнивание концентраций ионов К+ вне и внутри клетки и мем­бранный потенциал уменьшался до нуля.

Важнейшим механизмом, поддерживающим низкую внутрикле­точную концентрацию ионов Na+ и высокую концентрацию ионов К+, является натрий-калиевый насос (рис. 2.9). Известно, что в клеточной мембране имеется система переносчиков, каждый из ко­торых связывается с 3 находящимися внутри клетки ионами Na+ и выводит их наружу. С наружной стороны переносчик связывается с 2 находящимися вне клетки ионами К+, которые переносятся в цитоплазму. Энергообеспечение работы систем переносчиков обес­печивается АТФ. Функционирование насоса по такой схеме приводит к следующим результатам.

1. Поддерживается высокая концентрация ионов К+ внутри клет­ки, что обеспечивает постоянство величины потенциала покоя. Вследствие того что за один цикл обмена ионов из клетки выводится на один положительный ион больше, чем вводится, активный транс­порт играет роль в создании потенциала покоя. В этом случае говорят об электрогенном насосе. Однако величина вклада электрогенного насоса в общее значение потенциала покоя обычно невелика и составляет несколько милливольт.

2. Поддерживается низкая концентрация ионов натрия внутри клетки, что, с одной стороны, обеспечивает работу механизма генерации потенциала действия, с другой — обеспечивает сохранение нормальных осмолярности и объема клетки.

3. Поддерживая стабильный концентрационный градиент Na+, натрий-калиевый насос способствует сопряженному транспорту ами­нокислот и сахаров через клеточную мембрану.

Таким образом, возникновение трансмембранной разности по­тенциалов (потенциала покоя) обусловлено высокой проводимостью клеточной мембраны в состоянии покоя для ионов К+ (для мышечных клеток и ионов Сl-), ионной асимметрией концентраций для ионов К+ (для мышечных клеток и для ионов Cl-), работой систем активного транспорта, которые создают и поддерживают ионную асимметрию.

Рис. 2.9. Участие натрий-калиевого насоса в генерации потенциала покоя. А — внеклеточная среда; Б — внутриклеточная среда.

2.1.4. Потенциал действия

Емкость мембраны и работа метаболических ионных насосов приводят к накоплению потенциальной электрической энергии на клеточной мембране в форме потенциала покоя. Эта энергия может освобождаться в виде специфических электрических сигналов (по­тенциала действия), характерных для возбудимых тканей: нервной, мышечной, некоторых рецепторных и секреторных клеток. Под потенциалом действия понимают быстрое колебание потенциала покоя, сопровождающееся, как правило, перезарядкой мембраны. Форма потенциала действия аксона и терминология, используемая для описания потенциала действия, приведены на рис. 2.10.

Для правильного понимания процессов, происходящих при ге­нерации потенциала действия, используем схему опыта, приведен­ную на рис. 2.5. Если через стимулирующий электрод подавать короткие толчки гиперполяризующего тока, то можно зарегистри­ровать увеличение мембранного потенциала, пропорциональное ам­плитуде подаваемого тока; при этом мембрана проявляет свои ем­костные свойства — замедленное нарастание и снижение мембран­ного потенциала (см. рис. 2.6).

Ситуация будет изменяться, если через стимулирующий электрод подавать короткие толчки деполяризующего тока. При небольшой (подпороговой) величине деполяризующего тока мембрана ответит пассивной деполяризацией и проявит емкостные свойства. Подпороговое пассивное поведение клеточной мембраны называется элек­тротоническим, илиэлектротоном. Увеличение деполяризующего тока приведет к появлению активной реакции клеточной мембраны в форме повышения натриевой проводимости (gNa+). При этом проводимость клеточной мембраны не будет подчиняться закону Ома. Отклонение от пассивного поведения проявляется обычно при 50—80% значении порогового тока. Активные подпороговые изме­нения мембранного потенциала называются локальным ответом.

Рис. 2.10. Потенциал действия оди­ночной клетки и его фазы. А — реакция клеточной мембраны на деполяризующий стимул; Б — величина деполяризующего тока; 1 — локальный ответ; 2 — быстрая деполяризация; 3 — реверсия; 4 — реполяриэация; 5 — по­ложительный следовой потенциал. По оси абсцисс — отметка времени.

Смещение мембранного потенциала до критического уровня при­водит к генерации потенциала действия. Минимальное значение тока, необходимого для достижения критического потенциала, на­зывают пороговым током. Следует подчеркнуть, что не существует абсолютных значений величины порогового тока и критического уровня потенциала, поскольку эти параметры зависят от электри­ческих характеристик мембраны и ионного состава окружающей внешней среды, а также от параметров стимула. Зависимость между величиной стимулирующего тока и временем его действия рассмат­ривается в разделе 2.1.5.

В опытах Ходжкина и Хаксли был обнаружен, на первый взгляд, удивительный эффект. Во время генерации потенциала действия мем­бранный потенциал уменьшался не просто до нуля, как следовало бы из уравнения Нернста, но изменил свой знак на противоположный.

Анализ ионной природы потенциала действия, проведенный первоначально Ходжкиным, Хаксли и Катцем, позволил установить, что фронт нарастания потенциала действия и перезарядка мембраны (овершут) обусловлены движением ионов натрия внутрь клетки. Как уже указывалось выше, натриевые каналы оказались электроуправляемыми. Деполяризующий толчок тока приводит к активации натри­евых каналов и увеличению натриевого тока. Это обеспечивает ло­кальный ответ. Смещение мембранного потенциала до критического уровня приводит к стремительной деполяризации клеточной мембра­ны и обеспечивает фронт нарастания потенциала действия. Если уда­лить ион Na+ из внешней среды, то потенциал действия не возникает. Аналогичный эффект удавалось получить при добавлении в перфузионный раствор ТТХ (тетродотоксин) — специфического блокатора на­триевых каналов (см. табл. 2.1). При использовании метода «voltage-clamp» было показано, что в ответ на действие деполяризующего тока через мембрану протекает кратковременный (1—2 мс) входящий ток, который сменяется через некоторое время выходящим током (рис. 2.11). При замене ионов натрия на другие ионы и вещества, например холин, удалось показать, что входящий ток обеспечивается натрие­вым током, т. е. в ответ на деполяризующий стимул происходит повы­шение натриевой проводимости (gNa+). Таким образом, развитие фа­зы деполяризации потенциала действия обусловлено повышением на­триевой проводимости.

Критический потенциал определяет уровень максимальной акти­вации натриевых каналов. Если смещение мембранного потенциала достигает значения критического уровняпотенциала, то процесс по­ступления ионов Na+ в клетку лавинообразно нарастает. Система на­чинает работать по принципу положительной обратной связи, т. е. возникает регенеративная (самоусиливающаяся) деполяризация.

Перезарядка мембраны, или овершут, весьма характерна для большинства возбудимых клеток. Амплитуда овершута характери­зует состояние мембраны и зависит от состава вне- и внутрикле­точной среды. На высоте овершута потенциал действия приближается к равновесному натриевому потенциалу, поэтому происходит изме­нение знака заряда на мембране.

Рис. 2.11. Действие деполяризующего стимула (А), ионные токи (Б) и изменение проводимости клеточной мембраны (В) для ионов Na+ (gNa+, INa+) и K+ (gK+,IK+) во время действия деполяризующего стимула.

Экспериментально было показано, что амплитуда потенциала действия практически не зависит от силы стимула, если он превы­шает пороговую величину. Поэтому принято говорить, что потенциал д