Выявление БЛРС у штаммов Enterobacteriaceae фенотипическими методами.

Обоснованные рекомендации по выявлению БЛРС фенотипическими методами распространяются только на штаммы Klebsiella spp. и E.coli. Однако продукция БЛРС может отмечаться практически у всех видов семейства Enterobacteriaceae и ряда других грамотрицательных микроорганизмов. Учитывая распространенность ферментов этой группы, представляется целесообразным проведение скрининга всех выделенных в лаборатории штаммов Enterobacteriaceae с последующим использованием специальных подтверждающих исследований у любых штаммов, которые по данным предварительного тестирования проявляют пониженную чувствительность хотя бы к одному из цефалоспоринов III поколения (МПК > 2 мг/л, либо эквивалентное уменьшение диаметра зоны подавления роста – таблица 3).

Скрининг не предполагает проведения специального исследования, его основу должен составлять анализ данных, получаемых в рутинной практике. В то же время для эффективного скрининга в рутинное микробиологическое исследование необходимо включать несколько цефалоспориновых антибиотиков, даже если использование некоторых из них в качестве терапевтических препаратов не планируется. Наиболее чувствительными к гидролизу БЛРС считаются цефподоксим и цефтазидим. Соответственно, эти препараты целесообразно включать в набор для определения чувствительности Enterobacteriaceae. При отсутствии возможности тестирования цефподоксима, минимальный набор цефалоспоринов III поколения, используемых для определения чувствительности грамотрицательных микроорганизмов, должен включать цефотаксим, цефтриаксон и цефтазидим.

Чем больше цефалоспоринов использовано для тестирования, тем более достоверными будут результаты выявления БЛРС. Некоторые штаммы могут проявлять высокий уровень устойчивости ко всем АБП, у других же обнаруживается лишь незначительное повышение МПК к 1–2 АБП цефалоспоринового ряда. Результаты тестирования Klebsiella spp. и E. coli к цефалоспоринам, указывающие на возможную продукцию БЛРС этими штаммами, приведены в таблице 10.

После выявления штамма, подозрительного на продукцию БЛРС, рекомендуется провести подтверждающий тест.

 

Тесты, подтверждающие продукцию БЛРС.

Все фенотипические тесты для подтверждения продукции БЛРС являются вариантами стандартных методов определения чувствительности к АБП и основаны на ингибиции БЛРС клавуланатом. При постановке этих тестов проводится сравнение чувствительности исследуемых микроорганизмов к различным цефалоспоринам III поколения и к комбинации этих антибиотиков с клавулановой кислотой.

 

Диско-диффузионный метод предусматривает использование стандартных дисков с обычным содержанием цефотаксима и цефтазидима (30 мкг) или диска с цефподоксимом (10 мкг), а также диски, содержащие комбинации: цефотаксим + клавуланат или цефтазидим + клавуланат (30/10 мкг) или цефподоксим + клавуланат (10/10 мкг). В исследование целесообразно включать одновременно и диски с цефотаксимом и диски с цефтазидимом и их комбинациями с клавуланатом.

Постановка теста.

Методика приготовления микробной взвеси и инокуляции чашек с агаром стандартные. На поверхность агара накладывают диски
с цефалоспоринами и их комбинациями с клавулановой кислотой. Чашки инкубируют
в термостате при 35^оС в течение 18-20 часов.

 

Интерпретация результатов.

Различие в диаметрах зон подавления роста для дисков с цефподоксимом/клавулановой кислотой и цефподоксимом на 6 мм и более, дли дисков с цефотаксимом/клавулановой кислотой и цефотаксимом, цефтазидимом/клавулановой кислотой и цефтазидимом – на 5 мм и более, свидетельствует о продукции штаммом БЛРС. Необходимо подчеркнуть, что результат считается положительным, если указанные различия получены хотя бы для одной пары дисков.

 

Контроль качества.

Для контроля качества исследования необходимо использовать 2 штамма (отрицательный и положительный контроли):

- отрицательный контроль. При тестировании контрольного штамма E. coli, не продуцирующего b-лактамаз, различия в диаметрах зон между дисками с ингибитором и без него не должны превышать 2,0 мм.

- положительный контроль. При тестировании контрольного штамма K.pneumoniae, продуцирующего БЛРС, различия в диаметрах зон между дисками с цефподоксимом/клавулановой кислотой и цефподоксимом > 6 мм, с цефотаксимом/клавулановой кислотой и цефотаксимом >3 мм,
с цефтазидимом/клавулановой кислотой и цефтазидимом > 5 мм.

 

Метод серийных разведений в бульоне предполагает использование двойных серийных разведений препаратов в следующих диапазонах концентраций: цефтазидима
от 0,25 мг/л до 128,0 мг/л, цефтазидима/клавуланата от 0,25/4,0 мг/л до 128,0/4,0 мг/л; цефотаксима от 0,25 мг/л до 64,0 мг/л; цефотаксима/клавуланата от 0,25/4,0 мг/л до 64,0/4,0 мг/л. В исследование целесообразно включать оба цефалоспорина и их комбинации с клавулановой кислотой.

 

Постановка теста.

Методика выполнения исследования (приготовление разведений антибиотиков в бульоне, микробной взвеси, инокуляция и инкубация) – стандартная.

 

Интерпретация результатов.

Снижение МПК цефтазидима или цефотаксима не менее чем в 8 раз (на 3 последовательных двукратных разведения) в присутствии ингибитора, в сравнении со значениями МПК соответствующих цефалоспоринов без ингибиторов, свидетельствует о продукции штаммом БЛРС.

 

Контроль качества:

- отрицательный контроль. При тестировании контрольного штамма E. coli, не продуцирующего b-лактамаз, соотношения МПК соответствующих цефалоспоринов III поколения к МПК их комбинации с клавуланатом должны быть <8.

- положительный контроль. Для штамма K.pneumoniae, продуцирующего БЛРС, соотношения значений МПК цефалоспоринов и МПК их комбинаций с клавуланатом должны быть > 8.

 

Метод двойных дисков.

Хотя этот метод и не относится к хорошо стандартизованным, чувствительность, специфичность и простота выполнения позволяют рассматривать его приемлемым методом для рутинной практики. Метод предполагает использование доступных коммерческих дисков с цефалоспоринами III поколения и с амоксициллином/ клавуланатом.

Метод "двойных дисков" представляет собой вариант классического ДДМ определения чувствительности, который позволяет выявить продукцию БЛРС по наличию расширенной зоны подавления роста вокруг диска с каким-либо цефалоспорином III поколения напротив диска, содержащего клавулановую кислоту (синергизм отмечается в

 

 

участке пересечения зон диффузии двух дисков, расположенных на небольшом расстоянии друг от друга).

 

Постановка теста.

Методика приготовления микробной взвеси, инокуляции и инкубации чашек не имеет отличий от стандартного ДДМ. Особенностью метода является то, что через 5–10 мин. после инокуляции на поверхность агара накладывают диски с АБП: в центр – диск, содержащий клавулановую кислоту, обычно в виде комбинации амоксициллин/клавуланат (20/10 мкг), по бокам от него на расстоянии 20 и 30 мм между центрами дисков – диски с цефтазидимом (30 мкг) и цефотаксимом (30 мкг). Использование двух дисков каждого АБП, расположенных на разном расстоянии от диска с клавулановой кислотой, позволяет повысить эффективность обнаружения БЛРС.

Интерпретация результатов.

Если тестируемый микроорганизм вырабатывает БЛРС (действие которых в большинстве случаев обратимо клавуланатом), зона подавления роста вокруг диска с цефалоспорином III поколения окажется «вытянутой» в сторону диска с амоксициллином/клавуланатом (рис. 2). Причиной данного эффекта является дополнительное подавление роста микроорганизма в той зоне, куда диффундируют и клавуланат и цефалоспорин III поколения. Тест сугубо качественный и требует определенных навыков при интерпретации.

 

Рис. 2. Выявление продукции БЛРС с помощью метода "двойных дисков".
Отрицательные результаты: a) E.coli (БЛРС-)б b) E. cloacae (гиперпродукция AmpC).

Положительные результаты: c), d) K. pneumoniae (БЛРС+)
Обозначения дисков: AMC - амоксициллин/клавулановая кислота (20/10 мкг),
CAZ - цефтазидим (30 мкг), CTX - цефотаксим (30 мкг), CPO - цефпиром (30 мкг)

Контроль качества.

Параллельно с анализом исследуемых культур тестируют контрольные штаммы.

К сожалению ни один из традиционных микробиологических методов, основанных на оценке фенотипа микроорганизма, не обеспечивает выявление БЛРС в 100% случаев. Ситуация существенно затрудняется при наличии у микроорганизмов нескольких детерминант устойчивости одновременно, что встречается достаточно часто. Например, при продукции БЛРС и гиперпродукции хромосомных бета-лактамаз класса С устойчивость последних к клавуланату маскирует присутствие БЛРС.

6.3. Определение чувствительности P.aeruginosa, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. и других неферментирующих бактерий (НФБ).

При определении чувствительности НФБ следует иметь в виду, что ДДМ достаточно стандартизован лишь для P.aeruginosa и Acinetobacter spp. При исследовании Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas spp. (кроме P.aeruginosa) и других НФБ, предпочтение следует отдавать методам серийных разведений. Примерный перечень АБП, рекомендуемых для определения чувствительности рассматриваемой группы бактерий приведен в таблице 1211.

Препараты первого ряда.

В первую очередь для оценки антибиотикочувствительности Pseudomonas spp. и Acinetobacter spp. следует использовать препараты, отличающиеся наибольшей природной активностью. К ним относятся:

Цефтазидим. Является одним из основных АБП, используемых для лечения инфекций, вызываемых рассматриваемой группой микроорганизмов.

Цефепим. При сопоставимом с цефтазидимом уровне природной активности, в ряде случаев цефепим сохраняет активность в отношении микроорганизмов, устойчивых к цефтазидиму.

Гентамицин, амикацин. Аминогликозиды для монотерапии инфекций, вызываемых рассматриваемой группой бактерий не применяются, однако во многих случаях являются необходимым компонентом комбинированных схем терапии. Целесообразность включения в перечень препаратов первого ряда амикацина и гентамицина обосновывается высокой частотой устойчивости к последнему антибиотику в ряде учреждений.

Ципрофлоксацин. Среди фторхинолонов ципрофлоксацин является препаратом выбора при лечении рассматриваемой группы инфекций.

Меропенем, имипенем. Меропенем характеризуются наибольшим уровнем активности в отношении рассматриваемой группы микроорганизмов, имипенем ему несколько уступает. Целесообразность включения обоих карбапенемов объясняется отсутствием между ними в некоторых случаях перекрестной резистентности.

 

Дополнительные препараты.

Дополнительные препараты по уровню природной активности, как правило, уступают антибиотикам первого ряда, однако во многих случаях, прежде всего, по экономическим соображениям могут быть использованы в терапии. Кроме этого необходимо учитывать, что неферментирующие бактерии существенно различаются по уровню природной чувствительности к АБП.

Азтреонам, цефоперазон. По основным свойствам близки к цефтазидиму.

Цефоперазон/сульбактам, тикарциллин/клавуланат, Доступные ингибиторы не способны подавлять активность большинства бета-лактамаз распространенным среди P. aeruginosa и, в силу этого комбинированные препараты, не обладают существенными преимуществами с сравнении с исходными антибиотиками.

Цефоперазон/сульбактам (а также ампициллин/сульбактам) могут иметь реальное значение в лечении инфекций, вызываемых Acinetobacter spp. благодаря наличию у сульбактама собственной активности в отношении указанного микроорганизма.

При инфекциях вызываемых Stenotrophomonas maltophilia клиническое значение имеет ко-тримоксазол и тикарциллин/клавуланат. Микроорганизм обладает природной устойчивостью ко всем бета-лактамам кроме (тикарциллина/клавуланата)

Карбенициллин. В силу выраженной токсичности и высокой частоты устойчивости применение карбенициллина даже для лечения инфекций, вызываемых P. aeruginosa следует признать нецелесообразным.

 

Очевидно, что «неферментирующие» микроорганизмы нельзя рассматривать как единую группу с точки зрения их природной чувствительности к антибиотикам. Оценка антибиотикочувствительности редких видов «неферментирующих» микроорганизмов требует индивидуального подхода.

Поскольку тяжелые инфекции, вызываемые псевдомонадами, являются показанием для назначения комбинированной терапии, целесообразно при выдаче ответа в клинику указывать на наиболее эффективную с микробиологической точки зрения комбинацию антибиотиков.

Пограничные значения МПК антибиотиков (и соответствующие диаметры зон ингибиции роста) в отношении Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. и неферментирующих бактерий, используемые для интерпретации результатов оценки антибиотикочувствительности приведены в таблице 4.

6.4. Определение чувствительности Staphylococcus spp.

При оценке чувствительности Staphylococcus spp. в первую очередь необходимо тестировать препараты, имеющие основное клиническое значение: бета-лактамы, макролиды, фторхинолоны, аминогликозиды и ванкомицин.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности Staphylococcus spp. (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 5.

Бета-лактамы. Препаратами выбора для лечения стафилококковых инфекций (вызванных как Staphylococcus aureus, так и коагулазонегативными стафилококками) являются бета-лактамные антибиотики, следовательно, в первую очередь необходимо определять чувствительность стафилококков к этим препаратам.

Устойчивость стафилококков к бета-лактамным АБП связана либо с продукцией бета-лактамаз, либо с наличием дополнительного пенициллино-связывающего белка - ПСБ2а. Выявление и дифференцировка этих двух механизмов резистентности позволяет надежно прогнозировать активность всех бета-лактамных антибиотиков без непосредственной оценки чувствительности к каждому из этих препаратов. При этом необходимо учитывать следующие закономерности:

- штаммы Staphylococcus spp., лишенные механизмов резистентности, чувствительны ко всем бета-лактамным АБП;

- бета-лактамазы (пенициллиназы) Staphylococcus spp. способны гидролизовать природные и полусинтетические пенициллины, за исключением оксациллина и метициллина. Чувствительность или резистентность к бензилпенициллину является индикатором активности природных и полусинтетических амино-, карбокси- и уреидопенициллинов. Остальные бета-лактамы с потенциальной антистафилококковой активностью (антистафилококковые пенициллины, цефалоспорины I, II и IV поколений и карбапенемы) сохраняют активность в отношении бета-лактамазпродуцирующих штаммов;

- штаммы Staphylococcus spp, обладающие ПСБ2а, клинически устойчивы ко всем бета-лактамным АБП. Маркером наличия ПСБ2а является устойчивость к оксациллину и метициллину. Такие штаммы исторически получили название метициллинорезистентных стафилококков.

Метициллин в настоящее время в клинической практике и в лабораторной диагностике не применяется, его практически полностью вытеснил оксациллин, соответственно появился термин «оксациллинорезистентность», являющийся полным синонимом термина «метициллинорезистентность ».

 

Таким образом, определение чувствительности Staphylococcus spp. к бета-лактамным АБП должно включать выполнение двух тестов:

- определения чувствительности к бензилпенициллину или выявления продукции бета-лактамаз (пенициллиназ);

- определения чувствительности к оксациллину или выявления ПСБ2а или кодирующего его гена mecA.