Скрининг для выявления ванкомицинорезистентности у энтерококков.

Скрининг осуществляется на агаре.

Питательная среда.

Агар на сердечно-мозговом экстракте. Питательная среда готовится в соответствии с инструкцией производителя. После автоклавирования и охлаждения до 45⁰–50⁰С в среду асептически добавляют раствор ванкомицина до конечной концентрации 6,0 мг/л..

Приготовление микробной взвеси, инокуляция и инкубация.

Микробную взвесь готовят путем суспендирования изолированных колоний из 24-часовой культуры, выращенной на неселективных средах до концентрации 0,5 по Мак-Фарланду. Для скрининга на поверхность агара наносят 10,0 мкл суспензии. Инкубацию проводят при температуре 35⁰С в течение полных 24 ч.

Учет результатов.

Исследуемый штамм рассматривается как резистентный при росте более 1 колонии на агаре с ванкомицином.

Контроль качества

Для контроля качества используют штаммы чувствительных и резистентных энтерококков

6.6. Определение чувствительности микроорганизмов
со сложными питательными потребностями.

Определение чувствительности микроорганизмов со сложными питательными потребностями является методически одной из наиболее трудных задач, так как в ряде случаев требует одновременного использования метода серийных разведений и ДДМ, особой тщательности в выполнении всех процедур, начиная от приготовления питательных сред и инокулюма и заканчивая проведением контроля качества. В то же время эффективность эмпирической антибактериальной терапии многих инфекций, вызываемых микроорганизмами этой группы, хорошо предсказуема. Учитывая эти факты при оценке необходимости определения чувствительности микроорганизмов этой группы к АБП необходимо объективно оценить соотношение стоимости и эффективности (клинической значимости) таких исследований, а также сопоставить стоимость полноценного материально-технического оснащения с доступными ресурсами.

Попытки даже незначительной модификации стандартных методов (замена дорогостоящих реагентов на более дешевые) могут привести к получению ошибочных, недостоверных результатов, способных ввести в заблуждение и микробиологов, и клиницистов.

6.7. Определение чувствительности Streptococcus spp.

Питательные среды.

Для определения чувствительности стрептококков используют следующие питательные среды:

- для методов серийных разведений в бульоне необходимо использовать бульон Мюллера-Хинтон с добавлением 2,0 – 5,0% лизированной лошадиной крови. Кровь лизируют замораживанием - оттаиванием с последующим центрифугированием для освобождения от теней эритроцитов.

- для методов серийных разведений в агаре и ДДМ используют агар Мюллера-Хинтон с добавлением 5% дефибринированной бараньей крови.

Указанные добавки асептически вносят в питательную основу после автоклавирования и охлаждения до 48 – 50⁰С.

 

Определение чувствительности Streptococcus pneumoniae.

Бета-лактамные антибиотики (в частности пенициллин) являются препаратами выбора для терапии пневмококковых инфекций. В то же время критерии интерпретации результатов определения чувствительности пневмококков к этим препаратам постоянно пересматриваются в связи с появлением новых клинических и экспериментальных данных об эффективности различных бета-лактамов при пневмококковых инфекциях, вызванных штаммами с различным уровнем чувствительности к пенициллину.

Механизм резистентности S.pneumoniae к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам обусловлен изменением пенициллиносвязывающих белков (ПСБ) клеточной стенки. В результате ступенчатых мутаций уменьшается сродство ПСБ к бета-лактамным антибиотикам.

При этом установлено, что при лечении инфекций дыхательных путей, вызванных штаммами S. pneumoniae с промежуточным уровнем резистентности к пенициллину, бета-лактамные антибиотики остаются клинически эффективными, но применение их при менингите приводит к неудаче терапии.

В связи с этим при разработке критериев интерпретации результатов определения чувствительности S.pneumoniae к бета-лактамным антибиотикам было проведено подразделение штаммов по источникам выделения (инфекции дыхательных путей, ликвор) и пересмотрены критерии оценки чувствительности к амоксициллину, цефотаксиму и цефтриаксону. Критерии интерпретации результатов определения чувствительности к пенициллину не пересмотрены.

Следует обратить внимание на несколько важных особенностей определения чувствительности S. pneumoniae:

- невозможность определения чувствительности к бета-лактамным антибиотикам (пенициллину, аминопенициллинам, цефалоспоринам, карбапенемам) ДДМ;

- невозможность определения чувствительности S. pneumoniae к АБП методом разведений в агаре

Поэтому определение чувствительности пневмококков к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам подразумевает последовательное (выделение S. pneumoniae из нестерильных локусов) или одновременное (при тяжелых инфекциях, выделении пневмококков из крови и ликвора) выполнение двух исследований:

- скрининга с диском, содержащим 1,0 мкг оксациллина, с целью выявления возможной пенициллинорезистентности. Скрининговый метод позволяет разделить микроорганизмы на две группы: группу чувствительных штаммов и группу, в которую входят часть чувствительных, а также умеренно-резистентные и резистентные штаммы пневмококков.

- определение МПК пенициллина и других бета-лактамных антибиотиков методом разведений в бульоне или с помощью Е-тестов у штаммов, отнесенных ко второй группе по результатам скрининга.

 

Скрининг на наличие пенициллинорезистентности у штаммов S.pneumoniae.

Постановка теста.

Методика проведения исследования не отличается от обычной процедуры определения чувствительности пневмококков к АБП ДДМ.

Интерпретация результатов.

При выявлении диаметра зоны подавления роста штамма пневмококка вокруг диска
с 1 мкг оксациллина > 20 мм, S.pneumoniae расценивается как чувствительный ко всем бета-лактамным антибиотикам.

При выявлении диаметра зоны подавления роста <20 мм необходимо определение МПК всех бета-лактамных антибиотиков (пенициллина, аминопенициллинов, цефалоспоринов II-IV поколенй, карбапенемов) методами серийных разведений в бульоне или с помощью Е-тестов.

Макролиды и линкозамиды. Вторыми по значимости в лечении пневмококковых инфекций являются макролидные и линкозамидные антибиотики. Оценка чувствительности S. pneumoniae к перечисленным антибиотикам возможна как диско-диффузионным методом, так и методом серийных разведений. В связи с разнообразием механизмов устойчивости S. pneumoniae к макролидам в повседневной практике могут встречаться различные варианты перекрестной резистнетности микроорганизмов к АБП этой группы.

Однако в практических целях для характеристики чувствительности S. pneumoniae к рассматриваемой группе АБП достаточно оценить чувствительность к эритромицину и клиндамицину, что позволяет дифференцировать два основных фенотипа:

MLS_B – перекрестная устойчивость ко всем макролидам, линкозамидам и стрептограминам В, обусловленная метилированием мишени действия препаратов.

М – устойчивость к 14-ти и 15-членным макролидам (сохранении чувствительности к 16-ти членным макролидам, линкозамидам и стрептограминам), обусловленная активным выведением АБП.

Фторхинолоны. Традиционные фторхинолоны (пефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин и ломефлоксацин) не являются адекватными для лечения пневмококковых инфекций, соответственно оценивать чувствительность к этим препарата нецелесообразно. В последние годы в лечении пневмококковых инфекций важное место заняли антипневмококковые фторхинолоны (левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин и гатифлоксацин). Частота устойчивости к перечисленным препаратам минимальна, однако поскольку между ними не наблюдают полной перекрестной резистентности возникает необходимость включения в исследование всей группы

АБП других групп. Из антибиотиков других групп, для лечения пневмококковых инфекций применяют ко-тримоксазол, хлорамфеникол, тетрациклины. Однако роль перечисленных препаратов в последние годы резко снижается в связи нарастанием устойчивости, меньшей клинической эффективностью в сравнении с бета-лактамами, макролидами и антипневмококковыми фторхинолонами, также значительным числом нежелательных эффектов.

Для лечения тяжелых пневмококковых инфекций, вызванных штаммами с высоким уровнем устойчивости к антибактериальным препаратам других групп в ряде случаев рекомендуется ванкомицин.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности S.pneumoniae (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 7.

 

Определение чувствительности Streptococcus spp. группа «viridans”.

Проводить определение чувствительности штаммов стрептококков группы “viridans”, выделенных из нестерильных локусов в рутинной практике нецелесообразно. У штаммов, выделенных из стерильных в норме локусов организма, необходимо, в первую очередь, исследовать чувствительность к пенициллину. Воспроизводимые результаты при определении чувствительности стрептококков группы “viridans” к пенициллину удается получить только при помощи метода серийных разведений, ДДМ не пригоден для этой цели.

Штаммы, чувствительные к этому антибиотику следует расценивать, как чувствительные ко всем бета-лактамным антибиотикам. Часть штаммов, устойчивых к пенициллину, могут сохранять чувствительность к некоторым цефалоспоринам III поколения (цефотаксиму и цефтриаксону), IV поколения (цефепиму) и карбапенемам. Однако критерии интерпретации результатов определения чувствительности в настоящее время установлены только для цефотаксима и цефтриаксона.

Определенный интерес может представлять изучение чувствительности стрептококков группы “viridans” к эритромицину и другим макролидам, клиндамицину, тетрациклину и хлорамфениколу, однако клиническое значение получаемых при этом данных не определено.

В случае сниженной чувствительности или резистентности зеленящих стрептококков к пенициллину при выдаче результатов тестирования клиницистам целесообразно рекомендовать проведение комбинированной терапии бета-лактамами с аминогликозидами, которые проявляют синергизм при совместном применении с бета-лактамами, несмотря на отсутствие у аминогликозидов собственной значимой активности в отношении стрептококков.

Определение чувствительности бета-гемолитических стрептококков.

К бета-гемолитическим стрептококкам относятся микроорганизмы, принадлежащие к различным серологическим группам по Лансфельд (А, B, C, G). Среди них наибольшее клиническое значение имеют стрептококки группы А (Streptococcus pyogenes) и группы В (Streptococcus agalactiae).

Препаратами выбора для лечения инфекций, вызванных бета-гемолитическими стрептококками являются бета-лактамы, причем достоверных случаев устойчивости к АБП этой группы не описано. Не описана и устойчивость к ванкомицину. Следовательно, оценивать чувствительность к указанным АБП в рутинной практике нецелесообразно.

При выделении из нестерильных локусов необходимость в оценке чувствительности возникает только для S. pyogenes и S. agalactiae. Примерный перечень препаратов для определения чувствительности этих микроорганизмов включает: макролиды (эритромицин) и линкосамиды (клиндамицин). С целью мониторинга антибиотикорезистентности возможно определение чувствительности к хлорамфениколу и левофлоксацину. Для бета-гемолитических стрептококков, выделенных из стерильных локусов необходимо определять чувствительность ко всем вышеперечисленным препаратам одновременно.

Примерный перечень АБП, рекомендуемых для определения чувствительности S.pneumoniae, стрептококков группы “viridans” и бета-гемолитических стрептококков, выделенных из различных локусов организма, представлен в таблице 18.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности
Streptococcus spp. (кроме S.pneumoniae) (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 8.

6.8. Определение чувствительности Haemophilus influenzae.

Питательные среды.

Для определения чувствительности Haemophilus spp. используют специальную питательную среду, например HTM, содержащую необходимые для гемофил факторы роста.

Эту среду можно приготовить в лаборатории на основе среды Мюллера-Хинтона:

- среду готовят на основе бульона или агара Мюллера-Хинтон. После растворения основы в нее добавляют дрожжевой экстракт (до конечной концентрации 5 мг/мл)
и раствор гематина (до конечной концентрации 15 мг/л). Для приготовления основного раствора гематина 50 мг порошка помещают в 100,0 мл 0,01N NaOH
(0.01 моль/л) и нагревают при тщательном перемешивании до полного растворения.
В подготовленную для автоклавирования среду на 1 л вносят 30,0 мл основного раствора гематина;

- после автоклавирования и охлаждения основы до 48–50⁰С в нее асептически вносят раствор никотинамид аденин динуклеотида (НАД) до конечной концентрации
15 мг/л. Раствор НАД стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры
с размером пор 0,45 мкм;

- при определении чувствительности к сульфаниламидам и триметоприму
в охлажденную до 48 - 50⁰С среду асептически вносят также раствор тимидин фосфорилазы до конечной концентрации 0,2 ед/мл.

Haemophilus spp. характеризуются природной чувствительностью к большинству распространенных антибиотиков, в том числе, и к бета-лактамам. Практически важным исключением является отсутствие активности в отношении Haemophilus spp. у цефалоспоринов I поколения. Наибольшее значение имеет приобретенная резистентность к ампициллину, обусловленная продукцией плазмидных бета-лактамаз ТЕМ-1 и ROB-1. Кроме ампициллина эти ферменты частично гидролизуют цефалоспорины I поколения, но не активны в отношении препаратов II - III поколений.

Известны штаммы H.influenzae, устойчивость которых к ампициллину связана с изменением мишени действия b-лактамных антибиотиков (пенициллинсвязывающих белков) или снижением проницаемости наружной клеточной стенки. Эти штаммы получили название бета-лактамазонегативные ампициллинорезистентные (БЛНАР) и считаются нечувствительными к ингибиторозащищенным пенициллинам и таким цефалоспоринам, как цефаклор, цефуроксим, цефиксим, цефтибутен. До настоящего времени не получено клинических штаммов H.influenzae, устойчивых к цефалоспоринам III–IV поколений и карбапенемам.

Для выявления ампициллинорезистентности у гемофильной палочки в рутинной лабораторной практике достаточно определения чувствительности к ампициллину диско-диффузионным методом и теста на продукцию b-лактамаз с нитроцефином.

Эти два теста позволяют подразделить штаммы на ампициллиночувствительные, бета-лактамазопродуцирующие ампициллинорезистентные (чувствительные к ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам II–IV поколений) и БЛНАР, которые следует расценивать как резистентные к ингибиторозащищенным пенициллинам и некоторым цефалоспоринам. Причем тестирование с диском, содержащим ингибиторозащищенные пенициллины, например амоксициллин/клавуланат, не позволяет отличить БЛНАР от ампициллиночувствительных штаммов H.influenzae.

Макролидные антибиотики, в целом, отличаются невысоким уровнем активности в отношении Haemophilus spp., при этом между ними выявляются незначительные различия (наибольшая активность характерна для азитромицина). Низкий уровень активности макролидов связан с наличием у этого микроорганизма фоновой активности механизмов активного выведения. Подавляющее большинство штаммов H. influenzae с микробиологической точки зрения относятся к «дикой» популяции, лишенной дополнительных детерминант резистентности к этим АБП. Однако in vivo при приеме в рекомендуемых дозах концентрации макролидов органах и тканях оказываются недостаточными для обеспечения эрадикации патогена. Учитывая приведенные факты обоснованность критериев чувствительности H. influenzae к азитромицину и кларитромицину вызывает сомнения.

Устойчивость к фторхинолонам среди H. influenzae встречается редко, однако частота встречаемости штаммов с повышенными значениями МПК фторхинолонов возрастает, что обосновывает необходимость тестирования указанных АБП. Наиболее вероятно, что между отдельными представителями этой группы существует перекрестная резистентность, характерная и для других грамотрицательных бактерий.

Примерный перечень АБП, рекомендуемых для определения чувствительности H.influenzae, выделенных из различных локусов организма, представлен в таблице 2018.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности
H.influenzae (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 9

6.9. Определение чувствительности Neisseria gonorrhoeae.

Оценка антибиотикочувствительности N.gonorrhoeae представляет собой достаточно сложную методическую проблему. Методы определения чувствительности гонококков в бульоне недостаточно надежны, поэтому следует использовать только метод разведений в агаре или ДДМ.

Питательные среды.

Для определения чувствительности N.gonorrhoeae используют гонококковый агар, состоящий из гонококковой агаровой основы и комплексной питательной добавки следующего состава:

Глюкоза 100 г

L-цистеингидрохлорид 25,9 г

L-глютамин 10 г

L-цистин 1,1 г

Аденин 1 г

Никотинамидадениндинуклеотид 0,25 г

Витамин В12 0,1 г

Тиамина пирофосфат 0,1 г

Гуанина гидрохлорид 0,03 г

Fe(NO3)3.6H2O 0,02 г

Парааминобензойная кислота 0,013 г

Тиамина гидрохлорид 3 г

При тестировании карбапенемов и клавулановой кислоты необходимо использовать добавку, не содержащую цистеин.

Все ингредиенты растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и затем доводят объём до 1 л. КПД стерилизуют фильтрацией через бактериальный фильтр 0,02 мкм. КПД нельзя хранить и автоклавировать, необходимо использовать ex tempore. Полученную смесь асептически вносят в GC агар после автоклавирования и охлаждения до 48–50^оС в количестве 1,0% (объем/объем). Агар разливают в чашки Петри без добавления антибиотиков для ДДМ и с добавлением АБП для метода разведения в агаре.

Средствами выбора для лечения гонореи являются бета-лактамные антибиотики. Однако, среди штаммов N. gonorrhoeae широко распространена резистентность к пенициллину, тетрациклинам и макролидам. В ряде регионов Земного шара отмечают резкое возрастание частоты резистентности гонококков к фторированным хинолонам. Для практики крайне важно то, что до сих пор достоверно не описано случаев резистентности гонококков к цефалоспоринам III поколения, что позволяют рассматривать цефалоспорины III поколения (цефотаксим и цефтриаксон) как препараты выбора для лечения гонореи.

Таким образом, на практике оценивать антибиотикочувствительность гонококков следует только в тех случаях, когда для лечения невозможно или нецелесообразно использовать цефалоспорины III поколения. Такие ситуации складываются при наличии у пациентов аллергии к бета-лактамам или при смешанных гонорейно-хламидийных инфекциях, а также для эпидемиологического мониторинга.

В набор для тестирования N.gonorrhoeae рекомендуется включать фторхинолоны (офлоксацин или ципрофлоксацин), тетрациклины, спектиномицин. Дополнительно для более полной характеристики штаммов и эпидемиологического мониторинга целесообразно изучать чувствительность к пенициллину и цефалоспоринам II-III поколений.

Критерии оценки антибиотикочувствительности Neisseria gonorrhoeae приведены в таблице 10.