Локальные механизмы дифференцировки и детерминации

Под экспрессией гена понимают синтез в клетке функционально активной формы белка, кодируемого данным геном. Процесс реализации генетической информации у эукариот к настоящему времени достаточно хорошо изучен, однако регуляция этого многоступенчатого процесса очень сложна и неоднозначна (см. главу 2). Данные, накопленные в результате многолетней и кропотливой работы многих исследователей, позволяют выделить следующие возможные уровни регуляции биосинтеза белков, а, следовательно, и дифференцировки клеток, основанной, прежде всего, на приобретении клетками биохимических различий: регуляция путем соматических мутаций, регуляция транскрипции, регуляция процессинга мРНК и транспорта мРНК в цитоплазму, регуляция трансляции, регуляция на посттрансляционном уровне.

К регуляции путем соматических мутаций могут быть отнесены случаи качественного и количественного изменения генетического материала, происходящие в ходе развития в отдельных соматических клетках. Помимо элиминации хромосом, амплификации генов, образования политенных хромосом (см. п. 8.2.5.1), примером может служить перестройка генов иммуноглобулинов, в результате которой в организме человека иммунокомпетентные клетки могут синтезировать широкий спектр различных белков-антител. В организмах высших животных, в том числе человека, существует более миллиона клонов В-лимфоцитов, различающихся по продуцируемым антителам (иммуноглобулинам). Иммуноглобулины состоят из так называемых легких и тяжелых аминокислотных цепей. Гены для легких цепей содержат 2 вариабельных сегмента ДНК (V и J) и константный сегмент С. Сегмент V включает около 250 различных нуклеотидных последовательностей, а сегмент J - 4 таких последовательности. На нитях ДНК еще недифференцированных клеток участки V, J и С пространственно разделены. В эмбриональном развитии в ходе дифференцировки Б-лимфоцитов промежуточная ДНК элиминируется, и любая из V-последовательностей может сблизиться с любой из J-последовательностей, а их комбинация - с константным С-сегментом, т.е. происходят перемещения (транслокации) нуклеотидных последовательностей ДНК. Таким образом, может быть образовано около 1500 различных комбинаций генов. Гены для тяжелых цепей содержат вариабельные сегменты V, D и J, состоящие, соответственно, из 500, 15 и 4 последовательностей, а также константный участок С (рис. 8.24). Их комбинирование дает около 30 000 вариантов. При синтезе конкретного иммуноглобулина объединяются белки, кодируемые одним из генов легких цепей и одним из генов тяжелых цепей, что определяет возможность продуцировать около 100 млн различных типов антител.

 

Рис. 8.24. Рекомбинация генов, кодирующих тяжелые цепи иммуноглобулинов (V, D, J и С)

 

Подобные механизмы, в отличие от обсуждаемых далее, являются скорее исключением и обнаруживаются либо у отдельных видов животных, либо на определенных стадиях развития, либо обеспечивают реализацию конкретной внутриорганизменной задачи.

Как было установлено, в подавляющем большинстве случаев все соматические клетки организма имеют идентичный по количеству и содержанию набор ДНК. Наблюдаемая при их дифференцировке избирательная активность генов регулируется на разных стадиях процесса реализации генетической информации - от транскрипции до посттрансляционных изменений образованных полипептидных цепей - и базируется на действии многообразных механизмов. Экспрессия одного и того же гена может подвергаться действию различных регулирующих механизмов.

Регуляция транскрипции обеспечивает синтез первичных транс-криптов (пре-мРНК) только на определенных структурных генах. Некоторые примеры избирательной транскрипции обсуждались ранее - это синтез мРНК на выпетлившихся участках хромосом ооцита типа «ламповых щеток», а также на вздутых участках - пуфах - политен-ных хромосом в ядрах клеток слюнных желез некоторых насекомых (см. п. 2.4.3.4).

Наборы транскрибируемых генов отличаются в разных клетках на разных этапах развития, что и определяет направление их дифференцировки. В многомодульной регуляции транскрипции в эукариотических клетках принимает участие ряд нуклеотидных последовательностей ДНК, которые выполняют сервисные и регуляторные функции (см. п. 2.4.5.5). Прежде всего, это расположенные в непосредственной близости от кодирующих последовательностей гена участки ДНК: промоторы и операторы. Промоторы связывают РНК-полимеразу, комплекс общих транскрипционных факторов и специфические факторы транскрипции, операторы взаимодействуют с белками-регуляторами и веществами небелковой природы - эффекторами. Наличие нескольких промоторов в одном гене обусловливает альтернативную транскрипцию, т.е. образование различных форм мРНК при инициации считывания с разных промоторов. Так, в гене, кодирующем белок дис-трофин, имеется 8 промоторов, с которых происходит альтернативная транскрипция в разных тканях (сердечных и скелетных мышцах, эмбриональных нейронах, коре головного мозга, сетчатке глаз), что приводит к образованию в этих тканях различных изоформ белка. Обсуждается возможность формирования разных мРНК, транскрибируемых с одного гена, за счет использования альтернативных терминаторов (рис. 8.25).

Рис. 8.25. Схема возможных механизмов синтеза различных мРНК с одного гена

 

Помимо этого имеются области ДНК, называемые энхансерами. Они могут располагаться на значительном расстоянии от регулируемых генов (за тысячи нуклеотидов) и контролировать работу не одного конкретного, а целой группы доступных для них генов. Энхансеры связываются с комплексами белков, которые в зависимости от своего состава могут либо усиливать, либо подавлять транскрипцию данного структурного гена. Воздействие энхансера на конкретный ген осуществляется благодаря изгибу расположенного между ними участка ДНК, в результате чего комплекс энхансер-белки устанавливает непосредственный контакт со структурным геном (см. рис. 2.36). Изгиб становится возможен вследствие деконденсации участка ДНК, расположенного между энхансером и контролируемым им геном.

К процессам, регулирующим активность генов на уровне транскрипции, следует отнести также метилирование-деметилирование различных участков ДНК. Метилирование - присоединение метильной группы к цитозину, наблюдаемое в том случае, если рядом с ним находится гуанин, т.е. в составе динуклеотидов ЦГ (CpG). У млекопитающих в соматических клетках взрослого организма метилирование ДНК обычно происходит в последовательностях длиной 1000-2000 пар - CpG-островках, в которых содержание динуклеотидов ГЦ в 10-20 раз выше, чем в среднем по геному. CpG-островки присутствуют в 5' регуля-торных областях многих генов. Их метилирование препятствует взаимодействию регуляторных белков (факторов транскрипции) с промотором и блокирует активность генов. Обратный процесс - деметилирование приводит, соответственно, к деблокированию активности генов.

Одно из наиболее значимых в последние годы открытий в области регуляции генной экспрессии в раннем периоде онтогенеза млекопитающих - установление феномена перепрограммирования генома. На стадии дробления от зиготы до бластоцисты отмечается практически тотальное деметилирование генома, (за исключением импринтированных локусов (см. п. 4.1.1)), в результате чего происходит активация генов. Предполагается, что подобные преобразования генома существенны для обеспечения тотипотентности зиготы.

В период имплантации, когда наблюдается обособление зародышевых и внезародышевых листков (групп клеток), запускается процесс установления тканеспецифичного метилирования. При этом уровень метилирования ДНК в клетках трофобласта возрастает незначительно, в то время как ДНК клеток-производных внутренней клеточной массы, дающих начало эмбриональным структурам, подвергается существенному метилированию. Возрастающая плотность метилирования коррелирует с последующим сужением спектра возможных путей дифференцировки клеток. Показано, что рисунок метилирования оказывается специфическим для данного типа клеток и способствует поддержанию устойчивости его дифференцировки. У человека за процесс метилирования ДНК отвечают три фермента, называемые ДНК-метилтрансферазами (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b). Предполагается, что DNMT3a и DNMT3b - это метилтрансферазы, которые осуществляют формирование рисунка метилирования ДНК на ранних стадиях развития. DNMT1 является, предположительно, ферментом, поддерживающим метилирование ДНК на более поздних стадиях развития организма и отвечающим за присоединение метильной группы на комплементарной цепи при репликации ДНК дочерней клетки.

Установлено, что изменение доступности промоторов для белков, участвующих в транскрипции, и, следовательно, обеспечение избирательной экспрессии генов достигается также благодаря ацетилирова-нию гистонов. Гистоны целенаправленно модифицируются с помощью ферментов ацетилтрансфераз на тех промоторах, которые требуется активировать. Деацетилирование гистонов, в частности Н4, ремоделирует структуру хроматина, повышая степень его компактизации, что приводит к репрессии транскрипции.

Еще один механизм избирательной транскрипции структурных генов в дифференцирующихся клетках связан с пространственной организацией хромосом в интерфазных ядрах. Так, согласно некоторым данным, при дифференцировке В-лимфоцитов гены CD2, CD4, CD8-alpha, CD19, CD45-lambda5 включаются в состав гетерохроматина, в результате чего их экспрессия подавляется. Связь неактивных генов с гетерохромати-ном осуществляется с помощью белка Ikaros, который специфически связывается с промоторами генов и тем самым «рекрутирует» их в состав гетерохроматина.

Другой недавно обнаруженный фактор, влияющий на активность и, возможно, на специфичность транскрипции - размер петлеобразных участков ДНК - доменов, возникающих при прикреплении молекулы к ядерному матриксу (см. п. 2.4.3.2). У шпорцевой лягушки до 12-го деления дробления зародыша транскрипции на его генах не происходит, и петли хроматина не имеют постоянных точек фиксации на ядерном матриксе. С началом экспрессии собственного генома места их прикрепления точно фиксируются. По ходу развития размер хроматиновых петель, как правило, увеличивается. Кроме того, во всех клетках выявлены одинаковые петли ДНК, что позволяет сделать вывод о сохранении в ряду клеточных делений специфической организации доменов, разделенных зонами прикрепления. Предполагается, что при образовании петель могут фиксироваться позиции различных регуляторных элементов и их мишеней - структурных генов, способствуя их взаимодействию либо, наоборот, исключая его.

Регуляция процессинга РНК ранее обозначалась как посттранскрипционная. Считалось, что она осуществляется лишь после окончания транскрипции. По современным данным, однако, процессы «созревания» пре-мРНК протекают еще во время самой транскрипции - котранскрипционно.

Один из широко используемых механизмов в процессинге РНК - альтернативный сплайсинг. Как известно, только что транскрибированная молекула пре-мРНК состоит не только из участков, несущих генетическую информацию (экзонов), но и из некодирующих «вставок» (интронов). Еще в ходе транскрипции интроны удаляются из новосинтезированной мРНК. Оставшиеся экзоны могут соединяться в различных комбинациях, в результате чего из одной молекулы пре-мРНК может образоваться несколько типов более коротких молекул мРНК, кодирующих различные белки (изоформы белка) (см. п. 2.4.5.5, см. рис. 8.25). Было показано, например, что в результате альтернативного сплайсинга первичного транскрипта гена каль-цитонина могут быть образованы различные мРНК. В результате в клетках щитовидной железы он экспрессируется в виде гормона каль-цитонина, а в клетках гипофиза - в виде нейропептида CGRP, и эти пептиды будут участвовать в дифференцировке совершенно различных типов клеток.

Анализ сотен миллионов фрагментов РНК из разных тканей и органов человека показал, что до 60%, а по некоторым данным, до 94% генов подвергаются альтернативному сплайсингу, причем в разных тканях производятся разные наборы изоформ белков. Благодаря альтернативному сплайсингу разнообразие белков в организме млекопитающих значительно выше, чем у низших животных, хотя количество генов у тех и других примерно одинаково.

Интересно, что среди генов, сплайсинг которых отличается наиболее строгой тканеспецифичностью (в одних тканях всегда или почти всегда синтезируется только одна изоформа, в других - другая) повышена доля генов-регуляторов индивидуального развития, обмена веществ, межклеточных взаимодействий и передачи сигналов. Это именно те функции, от которых зависят структурные и функциональные различия между клетками и тканями.

В ходе формирования функционально активной мРНК может осуществляется также редактирование (эдитинг) РНК. Суть его состоит во внесении изменений в молекулу РНК - замена оснований, вырезание и вставка нуклеотидов, которые позволяют синтезировать иные полипептиды на отредактированных матрицах. Хорошо изучен процесс редактирования мРНК аполипопротеина В (АроВ) млекопитающих, участвующего в транспорте холестерина и триглицеридов. Обнаружены две формы AроB, кодируемые одним и тем же геном и образующиеся в результате редактирования AроB-мРНК. Ген AроB человека содержит 29 экзонов, и его общая длина составляет 43 тыс. п.о. Длина мРНК этого гена, кодирующей ApoB100, составляет 14 тыс. оснований. В середине самого большого экзона 26 имеется глутаминовый кодон CAA, который в результате редактирования мРНК превращается в нонсенс-кодон UAA, что приводит к образованию более короткой мРНК длиной в 7 тыс. оснований. В результате трансляции редактированной мРНК образуется укороченный AроB48. Полноразмерный белок Аро100 синтезируется в клетках печени и вовлечен в транспорт эндогенно синтезированных триглицеридов и холестерола, АроВ48 образуется в клетках кишечника и задействован в транспорте жиров, поступающих с пищей и всасывающихся в кишечнике.

Помимо указанных механизмов регуляции избирательной экспрессии генов на уровне процессинга РНК есть еще один - регуляция транспорта мРНК из ядра. Например, у млекопитающих лишь около 5% синтезированной РНК покидает ядро и транспортируется в цитоплазму. Достоверно неизвестно, каким образом происходит отбор конкретных РНК, подлежащих участию в трансляции. Однако изучение геномов различных млекопитающих позволяет указать один из механизмов такого отбора. Суть его заключается в том, что в молекулу РНК, служащую матрицей для синтеза белка, вносятся изменения, делающие молекулу «бессмысленной», и тогда она уничтожается. Обнаружено, что подобные изменения вносятся в ультраконсервативные участки ДНК, которые абсолютно идентичны у разных групп млекопитающих, в частности, у человека и мыши. Установлено, что таким образом происходит регуляция экспрессии генов, белки которых принимают участие в осуществлении альтернативного сплайсинга.

Следующий уровень регуляции избирательной экспрессии генов - уровень трансляции. Даже при одинаковом наборе готовых к трансляции мРНК клетки могут различаться между собой по времени начала и по скорости трансляции. Регуляция трансляции включает в себя репрессию-дерепрессию собственно трансляции, а также стабилизацию-дестабилизацию мРНК (см. п. 2.4.5.6). Наиболее общий пример регуляции такого рода - блокирование трансляции заготовленных в оогенезе материнских мРНК вплоть до активации яйцеклетки. Инактивацию и стабилизацию материнских мРНК в ооцитах обеспечивают определенные белки, например FRGY2 у шпорцевой лягушки или p50 у кроликов, участвующие в запасании мРНК в составе рибонуклеопротеиновых частиц - информосом.

В дальнейшем по ходу дробления материнская мРНК вступает в трансляцию также не сразу повсеместно, а по определенной пространственно-временной программе. Устранение блока трансляции на временно инактивированных мРНК после активации яйцеклетки достигается в том числе добавлением большого количества адениловых групп на 3'-конце молекул. Полиаденилирование происходит у многих эукариотических организмов и является крайне консервативным механизмом регуляции функционирования мРНК на ранних стадиях развития. Полиаденилирование осуществляется поли(А)-полимеразами (PAP), одна из которых находится в ядре, а другая локализована в цито плазме.

Существенные задержки в начале трансляции уже заготовленных мРНК отмечены также при дифференцировке эритроидных, спермато-генных и других специализированных типов клеток.

Изменение скорости трансляции наблюдается, например, в ходе дифференцировки клеток хрусталика куриного зародыша: на 6-е сутки эмбрионального развития на 1 молекулу мРНК синтезируется в 5 раз больше соответствующего белка (α-кристаллина), чем на 19-е сутки.

Недавно был открыт новый способ регуляции на уровне трансляции, основанный на так называемой РНК-интерференции. Это явление впервые было обнаружено у круглого червя Caenorhabditis elegans, а к настоящему времени выявлено у многих эукариотических организмов, в том числе у человека. В клетке на требуемых стадиях развития благодаря активности определенных генов и последующему процессингу возникают короткие молекулы РНК (размером 21-28 нуклеотидов). Они связываются с комплементарными участками транслируемых мРНК, что приводит к подавлению синтеза белка молекулы, а иногда и к деградации активных мРНК. Возможность РНК-интерференции установлена в цитоплазме яйцеклетки насекомых.

После завершения трансляции осуществляется посттрансляционная регуляция экспрессии гена. Вновь синтезированный полипептид, прежде чем стать функционально активным, проходит многочисленные превращения, например отщепление фрагментов, различные химические модификации, например добавление фосфатных или углеводных групп (ацетилирование, фосфорилирование и гликозилирование), изменение третичной структуры, образование в ряде случаев четвертичной структуры из нескольких субъединиц, наконец, так называемую «адресацию» - перемещение к месту окончательного функционирования.

Время и место посттрансляционных превращений, как правило, строго определены. Временная задержка посттрансляционных модификаций может быть достаточно большой. Например, фермент тирози-наза появляется у зародышей амфибий еще в раннем эмбриогенезе, но переходит в активную форму лишь после вылупления зародыша. Роль посттрансляционных модификаций в регуляции клеточной дифферен-цировки изучена еще далеко не достаточно, но предполагают, что она весьма значительна.

Таким образом, представленные в данном разделе механизмы регуляции избирательной экспрессии генов объясняют, каким образом в ходе индивидуального развития может осуществляться процесс диффе-ренцировки различных типов клеток. Следует иметь в виду, что избирательной экспрессии подвергаются, как правило, не отдельные гены, а целые группы (блоки) генов, обеспечивающие специфическую диффе-ренцировку клеток конкретного типа. После активации блока генов их экспрессия поддерживается на определенном уровне. Этим может быть объяснена высокая устойчивость дифференцированного состояния многих типов клеток.

Однако формирование целостного организма в ходе индивидуального развития не сводится только к приобретению специфичности конкретными группами клеток, поэтому применительно к многоклеточному организму клеточная дифференцировка неотрывна от пространственно-временных аспектов и, следовательно, от еще более высоких уровней ее регуляции, нежели уровни регуляции биосинтеза белка на клеточном уровне. На организменном уровне регуляция дифференцировки осуществляется благодаря системным механизмам развития или механизмам интеграции, реализация которых обеспечивает целостность и интегрированность организма на всех стадиях его онтогенеза, начиная с момента образования зиготы. Подробно эти механизмы рассматриваются в следующих разделах.