Сортировка и слипание клеток

Механизм сортировки и слипания (адгезии) клеток лежит в основе выделения и объединения клеток одного типа среди всех прочих. В процессе развития клетки «узнают» друг друга и сортируются в зависимости от свойств, т.е. образуют скопления и пласты избирательно, только с определенными клетками. Этот механизм крайне важен при формировании зародышевых листков в ходе гаструляции, образовании структур в органогенезе, осуществлении регенеративных процессов и иммунных реакций в постнатальном развитии.

Начало изучению сортировки и адгезии клеток положили эксперименты Таунса и Гольтфретера. Диссоциированные (см. разделенные) с помощью ферментов клетки зародыша амфибии на стадии гаструлы тщательно перемешивали и помещали в культуральную среду. Сначала клетки представляли собой беспорядочную смесь, затем клетки эктодермы, мезодермы и энтодермы разделялись (сегрегировали), собирались в отдельные группы, каждая из которых занимала свою определенную область. Локализация заново образованных зародышевых листков иногда даже соответствовала их положению в зародыше - эктодерма по периферии агрегата, энтодерма внутри, а мезодерма между ними (рис. 8.14).

Рис. 8.14. Адгезия клеток зародышевых листков: а - смесь диссоциированных клеток гаструлы амфибий; б - клетки эктодермы, мезодермы и энтодермы, группирующиеся послойно путем адгезии

 

Было установлено, что клетки зародышевых листков имеют избирательное сродство друг к другу: внутренняя поверхность эктодермы имеет положительное сродство к мезодермальным клеткам и отрицательное к энтодермальным. Мезодерма в свою очередь обладает положительным сродством и к экто-, и к энтодерме.

Многочисленные исследования, выполненные в последние годы, показали, что избирательная сортировка и адгезия клеток обеспечивается наличием на их мембранах так называемых молекул межклеточной адгезии (САМ, от англ. cell-adhesion molecules).

САМ - белки, связанные с плазматической мембраной клетки и обеспечивающие механическое взаимодействие клеток друг с другом. Часто они пронизывают мембрану и присоединяются к цитоскелету. Во многих случаях отдельная молекула способна взаимодействовать не с одним, а с несколькими веществами, для чего служат разные участки связывания. Обычно белки межклеточной адгезии расположены кластерами (группами) и образуют участки многоточечного связывания.

К молекулам адгезии относят 4 семейства белков: кадгерины, селектины, интегрины и семейство иммуноглобулинов. Опосредуемая ими адгезия может осуществляться на основе двух механизмов: гомофильного - молекулы адгезии одной клетки связываются с молекулами того же типа соседней клетки, и гетерофильного, когда две клетки имеют на своей поверхности разные типы молекул адгезии, которые связываются между собой (рис. 8.15).

Рис. 8.15. Механизмы межклеточной адгезии: а - гомофильный механизм; б - гетерофильный механизм

На этапах раннего эмбрионального развития основная роль в обеспечении механизма избирательной сортировки и адгезии клеток принадлежит кадгеринам. Остановимся на них более подробно.

Большинство кадгеринов представляют собой единожды пересекающие плазматическую мембрану гликопротеины, состоящие из 700-750 аминокислот. Внутриклеточные домены кадгеринов связаны с цитоплазматическими белками катенинами, а те, в свою очередь, - с цитоскелетом клетки - актиновыми филаментами (рис. 8.16). Кадге-рины являются Са²+-зависимыми, т.е. опосредуют клеточную адгезию только в присутствии ионов кальция. В отсутствие кальция кадгерины претерпевают значительную конформационную перестройку и в результате быстро разрушаются ферментами.

К настоящему моменту известно более десяти субклассов кадгеринов, каждый из которых кодируется отдельным геном. Клетки позвоночных экспрессируют один или более типов кадгеринов. Для конкретного типа клеток характерен определенный набор экспрессируемых кадгеринов.

Роль кадгеринов в развитии можно проиллюстрировать следующими примерами.

В начале дробления бластомеры располагаются рыхло. Затем происходит компактизация клеток - бластомеры прижимаются друг к другу, плотно упаковываются и связываются межклеточными соединениями (см. рис. 8.30). Ключевая роль кадгеринов в этом процессе доказана в экспериментах. Так, антитела к Е-кадгерину блокируют компактизацию бластомеров, тогда как антитела, реагирующие со многими другими поверхностными молекулами этих клеток, не оказывают такого действия. Этот же субкласс молекул адгезии наиболее важен и при формировании плотных контактов между клетками трофобласта в бластоцисте плацентарных млекопитающих. В зародыше трансгенных мышей, лишенных гена Е-кадгерина, не формируется трофобласт, и зародыш не имплантируется. Помимо Е-кадгерина важную роль в имплантации зародыша играет Р-кадгерин. Молекулы указанных субклассов экспрессируются на поверхности клеток трофобласта и матки, обеспечивая прилипание зародыша к эпителию матки на начальном этапе этого процесса.

 

Рис. 8.16. Схема взаимодействия молекулы кадгерина с цитоскелетом: 1 - клеточная мембрана; 2 - молекула кадгерина; 3 - катенины; 4 - актиновые фила-менты; 5 - межклеточное пространство; 6 - цитоплазма клетки

 

Очевидно, что кадгерины не менее значимы и на более поздних стадиях развития позвоночных, так как их появление и исчезновение коррелирует с важными морфогенетическими событиями, при которых ткани отграничиваются друг от друга. Так, клетки покровной эктодермы содержат Е-кадгерин. По мере формирования нервной трубки и отделения ее от покровной эктодермы в клетках развивающегося нервного эпителия исчезает Е-кадгерин и появляется iV-кадгерин (и N-CAM) (рис. 8.17). Присутствие различных субклассов кадгеринов на поверхности клеток покровной эктодермы и клеток формирующейся нервной трубки обеспечивает избирательную адгезию этих клеточных типов при смыкании нервных валиков. Интересно, что при миграции клеток нервного гребня из нервной трубки они теряют N-кадгерин (и N-CAM), но вновь начинают вырабатывать его позднее, когда, объединяясь, формируют нервный узел. Экспрессия CAM этих же двух семейств на поверхности мигрирующих мезенхимальных клеток, происходящих из склеротома, приводит к их объединению и последующему образованию кости. Механизм избирательной сортировки и адгезии лежит в основе и многих других процессов органогенеза, в частности, формирования мышечных волокон при слиянии клеток-миобластов, установление контактов между аксонами клеток сетчатки и нейронами других отделов зрительного анализатора и т.д.

Установлено, что число экспрессируемых на поверхности клеток кад-геринов также имеет значение при их избирательной сортировке и адгезии. В эксперименте были использовали две идентичные клеточные линии, отличающиеся по количеству синтезируемого Р-кадгерина. При смешивании клеток этих двух линий те из них, которые имели большее число молекул адгезии, демонстрировали более выраженное сцепление друг с другом и формировали плотную группу. Она окружалась клетками с меньшим числом молекул адгезии и, следовательно, образующими менее прочные контакты.

В процессе развития избирательное сродство клеток меняется. Этот факт подтверждается экспериментами по реагрегации диссоциированных клеток мезодермы куриных зародышей. Разделенные клетки головной части мезодермы, где уже были сформированы сомиты зародыша, после диссоциации легко реагрегировали в скопления, по размерам равные сомитам. Диссоциированные клетки из задних отделов, где еще не образовались сомиты, не реагрегировали с той же легкостью.

Рис. 8.17. Экспрессия кадгеринов: А - при формировании нервной трубки; Б - при выселении мезенхимальных мигрирующих клеток нервного гребня; 1 - эктодерма (Е-кадгерин); 2 - нервный желобок (N-кадгерин и N-CAM); 3 - нервная трубка (N-кадгерин и N-CAM); 4 - нервный гребень; 5 - мигрирующие клетки нервного гребня; 6 - хорда; 7 – сомит

 

Нарушение действия механизма избирательной клеточной сортировки и адгезии в ходе органогенеза приводит к формированию таких пороков развития, как несращение нервной трубки (spina bifida), несмыкание верхнечелюстных костей и их небных отростков (расщелина твердого неба). Мутация гена SOX-9 у человека проявляется в нарушении конденсации и адгезии клеток-предшественников при формировании хрящевых закладок костей и приводит к развитию кампомелической дисплазии. Это заболевание выражается в дефектах образования большинства костей тела и заканчивается смертью детей в период новорожденности от дыхательной недостаточности, вызванной аномалиями хрящей ребер и трахеи.

В постнатальном онтогенезе при нарушении синтеза молекул адгезии может наблюдаться торможение контактного ингибирования пролиферации клеток (см. п. 8.2.1), приводящее к образованию опухолей. Утрата их клетками молекул адгезии сопровождается стойкой дестабилизацией межклеточных контактов и последующим метастазированием. В частности, нарушение синтеза Е-кадгерина, вызванное мутациями кодирующих его генов, приводит к развитию диффузного рака желудка с ранним метастазированием и плохим прогнозом.

Таким образом, сортировка клеток и их избирательная адгезия наряду с другими клеточными процессами играют важную роль на протяжении всего онтогенеза, начиная с самых ранних его этапов, обеспечивая нормальное развитие и функционирование организма. Как и все прочие механизмы развития, клеточная сортировка и адгезия подвержены генетическому контролю.

ГИБЕЛЬ КЛЕТОК

Наряду с описанными выше делением, сортировкой и миграцией клеток, важную роль в индивидуальном развитии организмов играет процесс программированной гибели клеток, или апоптоза. В эмбриогенезе он является одним из основных механизмов органогенеза и метаморфоза, способствует достижению характерных для определенного биологического вида черт его морфофункциональной организации. В постнатальном развитии апоптоз обеспечивает гибель клеток на терминальных стадиях дифференцировки (например, эритроцитов), стареющих и поврежденных клеток, уничтожение аутореактивных, т.е. действующих против собственных клеток, клонов лимфоцитов и т.д. Помимо этого на протяжении всего развития механизм программированной клеточной гибели обеспечивает регуляцию численности клеток, а именно - установление нужного равновесия между процессами пролиферации и гибели клеток, что в одних ситуациях обеспечивает стабильное состояние организма, в других - рост, в-третьих - атрофию тканей и органов.

В настоящее время различают два принципиально различных типа клеточной гибели: апоптоз (в переводе с греческого «отпадающий») и некроз (см. п. 3.1.2).

Некроз представляет собой патологическую форму смерти клеток в результате их острого повреждения. Он характеризуется разрывом ци-топлазматической и внутриклеточных мембран, что приводит к разрушению органелл, высвобождению лизосомальных ферментов и выходу содержимого цитоплазмы в межклеточное пространство, при этом часто развивается воспалительный процесс, захватывающий территорию от части клетки до целого органа (см. рис. 3.5).

В отличие от некроза, апоптоз - генетически контролируемая клеточная гибель, которая приводит к «аккуратной» разборке и удалению клеток. Он широко распространен и типичен для физиологических условий. В процессе апоптоза наблюдаются следующие морфологические изменения (см. рис. 3.5). Клетка уменьшается в размерах, цитоплазма уплотняется, органеллы располагаются более компактно. Происходит конденсация хроматина под мембраной ядра, при этом образуются четко очерченные плотные массы различной формы и размеров. Ядро может разрываться на два или несколько фрагментов. Затем в апоптоти-ческой клетке формируются глубокие впячивания мембраны, что приводит к фрагментации клетки и формированию окруженных мембраной апоптотических телец, состоящих из цитоплазмы и плотно расположенных органелл, с фрагментами ядра или без них. После чего очень быстро происходит их фагоцитоз, который осуществляется как макрофагами, так и окружающими здоровыми клетками. Очень важно, что при апоптозе не развивается воспалительный процесс и гибель отдельных клеток или их групп происходит избирательно, без повреждения окружающих здоровых клеток.

Выделяют два вида программированной клеточной гибели: апоптоз «изнутри» и апоптоз «по команде».

В первом случае задача процесса - убрать поврежденные клетки. Апоптоз запускается сигналами, возникающими внутри самой клетки при неудовлетворительном ее состоянии - повреждении хромосом, внутриклеточных мембран и т.д.

Второй вариант апоптоза наблюдается во вполне нормальных и жизнеспособных клетках, которые с позиции целого организма оказываются ненужными или вредными. В этом случае клетка получает из внеклеточной среды, например от окружающих клеток, сигнал «погибнуть», который передается через мембранные или, реже, цитоплазма-тические рецепторы. Иногда сигналом для начала апоптоза может быть и отсутствие необходимого сигнала. В результате контакта сигнальных молекул с наружной частью белка-рецептора последний претерпевает структурные изменения, что тем или иным способом приводит к запуску реакций клеточной гибели.

Механизмы апоптоза многообразны. Они представляют собой сложнейшие молекулярные каскады, изучением которых занимаются многие лаборатории по всему миру. Остановимся на роли некоторых основных участников этих каскадов.

Реализуемые в организме схемы осуществления апоптоза различаются в основном своими начальными стадиями (рис. 8.18). Большинство из них осуществляется с участием белка р53 и лишь небольшая часть, например запускаемая с рецепторов ФНО, реализуется без его участия (см. п. 3.1.2).

Какими бы сигналами ни запускалась программируемая клеточная гибель - разнообразными внешними или внутренними, - если в схеме принимает участие белок р53, то происходит его накопление и увеличение активности.

Белок p53 в норме присутствует во всех типах клеток. Он локализуется в ядре, где функционирует как транскрипционный фактор. В его молекуле у человека - 392 аминокислотных остатка, образующих шесть различных по размеру и функции доменов (блоков).

Центральный и самый большой домен (включающий около 200 остатков) отвечает за узнавание энхансеров генов-мишеней и связывание с ними. В результате изменяется активность нескольких групп генов и среди них - генов, продукты которых принимают участие в реализации апоптоза. К последним относятся гены, кодирующие белки, стабилизирующие мембраны митохондрий (BCL2, BCLK и др.) и наоборот, повышающие их проницаемость (например, ВАХ, ВАD, BAK). Изменение соотношения этих белков в цитоплазме клетки вызывает повышение проницаемости мембран митохондрий, вследствие чего ее покидают белки, активирующие каспазный каскад через каспазу 9 (Aif, Цит C). Включение апоптозного пути через рецепторы без вовлечения белка р53 активирует этот же каскад, но через каспазу 8.

Рис. 8.18. Обобщающая схема некоторых механизмов апоптоза: R - рецептор; ФНО - фактор некроза опухолей

Каспазы - семейство белков, являющихся непосредственными участниками внутриклеточных реакций, обеспечивающих апоптоз. Кас-пазы представляют собой ферменты - сериновые или цистеиновые ци-топлазматические протеазы, в зависимости от наличия в их активном центре соответствующей аминокислоты. В своих белках-мишенях каспазы разрывают те пептидные связи, которые образованы с участием остатка аспарагиновой кислоты. Считают, что эти ферменты находятся в цитоплазме практически всех клеток, и до инициации реакций клеточной гибели они присутствуют в виде неактивных предшественников - прокаспаз. Последние активируются путем ряда модификаций. Известно 14 каспаз, которые подразделяются на инициаторы, эффекторы и стимуляторы. Каспазы способны в определенной последовательности активировать друг друга, образуя своего рода каскад, причем разветвленный. Инициаторы (каспаза 8 и 9) расщепляют и активируют каспазы-эффекторы. Одна из них - узловое звено каспазного каскада - каспаза 3. Ее мишени - как другие участники этого каскада, так и, возможно, некаспазные белки. Функция завершающих членов каскада - ограниченный протеолиз (разрушение) некоторых цитоплазматических и ядерных белков, что и приводит к развитию морфологических проявлений апоптоза.

В эмбриональном периоде развития основным видом программированной клеточной гибели является апоптоз «по команде».

Особое значение этот клеточный механизм имеет для многих формообразовательных процессов. Так, разделение пальцев на руках или ногах зародыша, разделение локтевой и лучевой костей предплечья, формирование суставов основано на гибели клеток, которая осуществляется избирательно, в определенных участках зачатков конечностей (рис. 8.19). Образование полостей сосудов (кавитация), которые первоначально представляют собой тяжи клеток, разделение верхнего и нижнего век и многие другие процессы развития имеют в своей основе механизм избирательной клеточной гибели.

Апоптоз обеспечивает также и исчезновения органов. Таким образом происходит резорбция личиночных органов животных при метаморфозе, например жаберных лепестков, хвоста и кишечника у головастиков.

Рис. 8.19. Апоптоз во время нормального развития конечности мыши: а - клетки, подвергающиеся апоптозу, мечены желтым; б - та же конечность через 1 сут

 

Подобные примеры имеют место и в эмбриональном развитии человека. Как и у других млекопитающих, у человека закладываются 9-10 хвостовых позвонков, волосяной покров, шесть или семь зачатков пальцев. Наблюдаемая в последующем развитии гибель клеток в этих закладках приводит к тому, что в копчике остается 4-5 позвонков, редуцируется большинство волосяных зачатков, а конечности становятся пятипалыми. В ходе развития мочеполовой системы погибают клетки предпочки и туловищной почки, в центральной нервной системе происходит гибель части нейронов, что в большинстве случаев обусловлено отсутствием контакта с клетками-мишенями.

Нарушение механизма программированной клеточной гибели приводит к формированию аномалий развития, таких как синдактилия (сращение пальцев), гипертрихоз (повышенное оволосение), полидактилия (многопалость) (рис. 8.20).

Как уже было сказано, процесс апоптоза требует скоординированной регуляции экспрессии многих генов. Нарушения синтеза белковых продуктов любого из них влекут за собой сбои в развитии и функционировании различных клеточных популяций. Так, к настоящему времени установлено, что активность гена белка bcl-2 требуется для поддержания жизнеспособности лимфоцитов, меланоцитов, эпителия кишечника и клеток почек во время развития эмбриона. Продукт гена bcl-x необходим для ингибирования смерти клеток в эмбриогенезе, особенно в нервной системе. Экспрессия гена Bax требуется для апоптоза тимоцитов и поддержания жизнеспособности мужских половых клеток в ходе гаметогенеза. Как в раннем, так и в постнатальном развитии механизм клеточной гибели используется организмом для предотвращения несанкционированной пролиферации поврежденных или патологически измененных клеток. Мутации гена p53 обнаруживаются примерно в половине опухолей, независимо от их происхождения или типа. Мыши, у которых отсутствовали оба этих гена, проявляли чрезвычайно высокую склонность к развитию злокачественных образований в результате полного или частичного нарушения апоптоза предопухолевых клеток.

Таким образом, программированная клеточная гибель является естественным, эволюционно обусловленным и генетически контролируемым механизмом развития, активно реализуемым организмом на различных стадиях онтогенеза для решения широкого спектра задач.

Рис. 8.20. Полидактилия кисти и стопы

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК

Еще один клеточный механизм развития - дифференцировка клеток (см. раздел 3.1.3). Именно благодаря ей однородный клеточный материал зародыша становится разнородным, образует ткани, входит в состав различных органов и систем, т.е. дифференцировка клеток является основой процесса дифференциации частей и структур зародыша.

Так, в эмбриогенезе человека из одной соматической клетки - зиготы - формируется особь, имеющая нервную, мышечную, соединительную и эпителиальную ткани, в состав которых входит более (не менее) 220 клеточных типов (например, клетки соединительной ткани - остеоциты, хондроциты, фибробласты, лейкоциты, эритроциты и т.д.). Клетки и ткани образуют опорно-двигательную, сердечно-сосудистую, мочеполовую, иммунную и другие системы органов. Напомним, что истинная многоклеточность - это многотканевый организм.

Клеточной дифференцировкой (цитодифференцировкой) называется процесс приобретения клетками биохимических, морфологических и функциональных различий. Другими словами, это процесс, в результате которого клетка становится специализированной, имеющей характерное строение, определенный тип метаболизма, и способной к выполнению определенных функций.

Как правило, дифференцируются не отдельные клетки, а группы сходных клеток, которые претерпевают постепенные изменения на протяжении нескольких клеточных циклов. Дифференцировка клеток, гистогенез и морфогенез совершаются в совокупности, причем в определенных участках зародыша и в определенное время. Это очень важно, потому что указывает на координированность и интегрированность эмбрионального развития. Первые биохимические и морфогенетические различия между клетками у большинства позвоночных обнаруживаются в период гаструляции.

Для недифференцированного состояния клетки характерны относительно крупное ядро и высокое ядерно-цитоплазматическое отношение, диспергированный хроматин (преобладает эухроматин) и хорошо выраженное ядрышко, многочисленные рибосомы и интенсивный синтез РНК, высокая митотическая активность и неспецифический метаболизм (активны гены «домашнего хозяйства»). Все эти признаки изменяются в процессе дифференцировки, характеризуя приобретение клеткой специализации.