Схема постановки реакции преципитации

1. По типу реакции флоккуляции.Реакция ставится в узких преципитационных пробирках диаметром 0,5 см, высотой 7— 10 см.

Ингредиенты

Опыт

Контроль

Преципитирующая сыворотка, мл

0,5

-

Нормальная сыворотка того же вида животного, мл

-

0,5

Преципитиноген в различных или одних разведениях

0,5

0,5

Встряхнуть, инактивировать при +37 С° 2 часа или 18 – 20С° 18 – 20 часов

Учет реакции по наличию хлопьев преципитации

+

-

 

При положительной реакции на дно пробирки выпадают хлопья преципитата (флокулята — рыхлые хлопьевидные агрегаты).

2. По типу реакции кольцепреципитации. В 2 узкие (преципитационные) пробирки налить по 0,1 — 0,2 мл иммунной преципитирующей сыворотки (опыт) и нормальную неиммунную сыворотку того же вида (контроль), затем осторожно по стенке пробирки наслоить термопреципитиноген (например, гаптен). Реакцию учитывают при содержании пробирок либо в термостате, либо при комнатной температуре. В опытной пробирке на границе обеих жидкостей в течение З — 10 минут образуется плотное мутно-белое кольцо — кольцо преципитации. В контроле такого кольца нет.

З. Диффузионный метод преципитации в геле. Принцип метода: вещества (антиген, антитела), диффундирующие в геле навстречу друг другу, реагируя между собой, образуют преципитат беловатого цвета разной конфигурации. В контроле он не наблюдается.

 Ингредиенты и техника постановки реакции:

- Готовят 1 - 1,5 % голодный агар - агар, разливают его в горячем расплавлен­ном виде в любые стеклянные объекты: в чашки, на отмытые фотопластины, на предметные стекла (для микрометода). Дают застыть.

- Под объекты подкладывают бумажные расчерченные ориентиры и специальным пробойником делают на равном расстоянии друг от друга лунки. Дно их заливают 1 каплей жидкого агара для избежания затекания реагентов под агар.

- Вносят в лунки 0,1 - 0,5 мл испытуемого вещества (антигена) и напротив специфические преципитирующие сыворотки с антителами.

 

АТ-6

АТ-1

АТ-2

АТ-3

АТ-4

АТ-5

АГ

а)

б)

в)

АГ-1

АГ-2

АГ-3

АГ-4

АТ

 

- Выдержать в термостате 18 - 24 часа, накрыв реагенты крышкой или стеклом для предохранения от испарения.

- Учет результатов ведут по появлению линии преципитата между содержи­мым лунок.

- Метка позволяет дифференцировать родство между антигенами (рис. справа). Концевое слияние полос свидетельствует о полной идентичности антигенов; (а)  при стыке полос - неполное родство (б) перекрест - разные антигены, но есть групповые антигены (в).

 4. Капиллярная реакция преципитации подобна первым методам, но ставится в капиллярах из комплекта для определения СРБ (С реактивного белка).

ОПЫТ

КОНТРОЛЬ

АГ

СЫВОРОТКА

АТ-(N)

+АТ

 

 

 

Методика: В отличие от пробирочного метода первым набирают лёгкий по массе АГ, затем сюда же – сыворотку с тяжелым АТ. После этого оба капилляра вертикально фиксируют в пластине.

Учёт результата производят в опытной пробе по кольцу преципитации на границе АГ и АТ. В контроле его нет.

Приложение 22

РАДИОИММУННЫЙ МЕТОД (РИМ)

Сущность метода: метод позволяет в любом биологическом субстрате (моче, крови и т.д.) определять ничтожно малые концентрации растворимых антигенов, продукты метаболизма микроорганизмов, гормоны и пр. на основе конкуренции с радиоактивным антигеном.

Этапы постановки реакции

1. Стандартное количество антигена, идентичного меченому радиоактивной меткой (например, I ¹²³ , I ¹³¹, либо другими изотопами) антигену, наливают в пробирку.

2. Добавляют стандартное количество иммунной сыворотки, специфичной антигену. 70- 80% меченого антигена связывается при этом с антителами, образуя радиоактивный преципитат.

3. Добавляют субстрат, исследуемый на присутствие предполагаемого антигена. Если в субстрате есть антиген, идентичный меченому, то он конкурирует с ним, отнимая антитела. Радиоактивность преципитат при этом снижается.

Чем больше в субстрате антигена, тем меньше радиоактивность преципитата.

Приложение 23

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД

Сущность метода:  конъюгат, образованный антителами, фиксированными на стенке лунки полистироловой пластины, и антигеном, взаимодействует с антителами, мечеными ферментом (чаще всего пероксидазой хрена) и также остаются на стенке пробирки. Не фиксированные (не отреагировавшие) субстраты сливаются из лунки и заменяются хромогеном с субстратом для индикации данного фермента. К примеру, хромогеном может служить ортофенилендиамин, субстрат для пероксидаз - перекись водорода.

Если в исследуемом субстрате были антигены, идентичные антителам, то энзим фиксируется на стенке лунки, разлагает перекись водорода и выделившийся кислород окрасит хромоген в желтый цвет.

 

Приложение 24

МЕТОД ИММУНОБЛОТТИНГА

для выявления антител в сыворотках крови больных к определенным антигенам возбудителя

Принцип метода:

1. Разделенный с помощью электрофореза комплекс антигенов в испытуемом субстрате наносят на полоску из нитроцеллюлозы. При этом разные антигены в силу разницы в электрофоретической подвижности располагаются в различных участках полоски.

2. Дальнейшее сравнительное исследование проводят по схеме сопоставления анализируемого образца с эталоном.