Лабораторная диагностика хламидиозов

Для диагностики хламидиозов используются методы, направленные на выявление возбудителя или его антигенов или же антихламидийных антител.

Таблица. Методы лабораторной диагностики хламидиозов.

 

Методы	Цель	Используемые тесты
Морфологические	Выявление морфологических структур возбудителя	Окраска препаратов по Романовскому – Гимзе, раствором Люголя и др. Иммунофлюоресцентный анализ (ИФА прямой и непрямой).
Культуральные	Выделение возбудителя	Культура клеток Нужные эмбрионы Лабораторные животные
Иммунологические	Выявление • антигена и                • антитела	МФА прямой, ИФА и др. РСК, МФА прямой, ИФА и др.
Молекулярно- биологические	ДНК диагностика	Гибридизация, амплификационные тест – системы (ПЦР, ЛЦР и др.)

 

Выбор того или другого метода, прежде всего, зависит от возможности лаборатории и характера процесса. Более достоверные ответы можно получить при одновременном использовании нескольких методов.

 

Забор материала

Материалом для исследования при урогенитальном хламидиозе являются мазки, соскобы со слизистой оболочки уретры, цервикального канала, шейки матки, прямой кишки, конъюктивы и т. п., которые забирают ложечкой Фолькмана, тампоном, платиновой петлёй или специальными щёточками. Для исследования можно также использовать сперму, сок простаты.

Забор материала проводится до лечения антибиотиками. Перед взятием материала из мочеполового тракта больные не должны мочиться 1 – 1,5 часа.

 

* Морфологические (цитологические) методы основаны на выявлении включений хламидий при использовании различных методов окраски. До недавнего времени наиболее распространёнными методами были окраска по Романовскому – Гимзе и раствором Люголя.

При окраске по Романовскому – Гимзе цитоплазматические включения видны как округлые или полулунной формы структуры красно – фиолетового цвета (ЭТ) или сине – фиолетового цвета РТ.

При окраске раствором Люголя включения красно – коричневого цвета в клетках, окрашенных в жёлтый цвет. В последнем случае препараты легче просматривать, но чувствительность этого метода невысокая – 25 – 30 %, а по некоторым данным – 5 – 15 %, как впрочем, и при окраске по Романовскому – Гимзе в случае урогенитального хламидиоза. При конъюктивите чувствительность несколько выше 30 – 60 %.

Несмотря на простоту метода, на просмотр препарата уходит 36 – 40 минут, и метод не применим для скрининга. Кроме того, возможно обнаружение псевдовключений.

Более высокой чувствительностью (90 – 95 %) и специфичностью до 98 % обладает иммунофлюоресцентный анализ, который приказом МЗ РФ регламентирован для постановки диагноза хламидиоза.

Используют как прямую РИФ, так и непрямую. При прямой РИФ используются моноклональные антитела, меченные флюоресцирующим изотиоционатом против главного белка внешней мембраны хламидий, имеющегося во всех 15 известных сероварах C. trachomatis. В люминисцентном микроскопе ЭТ и РТ видны как ярко – зелёные на красно – коричневом фоне окрашенных клеток. Оценка проводится по 50 клеткам.

 

* Культуральные методы

Для исследования можно использовать различные культуры: Hela L – 929, культуру 21 из клеток почек хомячков, но, по мнению большинства исследователей, лучшей является культура клеток Мак – Коя (Mc Coy).

Культуральные методы являются достаточно дорогостоящими, требуют от персонала специальных знаний, а также особого оборудования и занимают много времени. Достоинством является высокая чувствительность и 100 % специфичность.

 

* Иммунологические методы

Наряду с прямой реакцией иммунофлюоресценции для выявления антигена используется ИФА. Твердофазный ИФА на основе моноклональных антител основан на наличии у хламидий термостабильного родоспецифического (LPS) антигена. Чувствительность метода – 80 – 95 %, специфичность – 90 %.

Также используется иммуноэнзимный метод (ELJSA). При этом используется Ат, конъюгированные с ферментом (пероксидаза хрена, щелочная фосфотаза и др.).

 

* Молекулярно – биологические методы:

а) основаны на выявлении хламидийной ДНК (РНК) в образцах путём гибридизации нуклеиновых кислот с использованием ДНК – зонда, меченного биотином;

б) в последние годы широко используется ПЦР (PCR) и лигазная цепная реакция – ЛЦР (LCR).

Урогенитальный хламидиоз нередко протекает с осложнениями, при которых возбудитель недоступен. Поэтому используются серологические реакции для выявления Ат: РСК, РНГА, реакция радиоиммунопреципитации (РИА), иммунофлюоресценция (МФА – JFA), иммунопероксидазные методы (ИПА – JPA), иммуноферментный анализ (ИФА – EJA/ ЕLJSA), микроиммунофлюоресценция (МИФ).

 

Микоплазмы

 

Микоплазмы – группа антропонозных инфекционных болезней, вызываемых микоплазмами, характеризуются поражением органов дыхания и мочеполовых органов.

Таксономия:

Класс:              Mollicutes («мягкокожие»)

Порядок:         Mycoplasmatales

Семейство:      Mycoplasmataсeae

Род:                  Mycoplasma (включает ≈ 100 видов)

                         Ureapеasma (насчитывает 3 вида)

 

Виды              (патогенные для человека):

- M. pneumoniae

- M. hominis

- M. genitalium

- Ureaplasma urealyticum

 

Первые патогенные микоплазмы были выделены Нокаром, Ру, Бореллем (1893 – 1898 гг.) от животных. Полное морфологическое описание возбудителя проведено Борде (1910) и Бореллем (1910), М. Г. Тарковский и Е. П. Джунковский позднее разработали методы их культивирования.

Первые патогенные для человека микоплазмы были выделены из абсцесса бартолиновых желёз Диенесом и Эдзаллом (1937), а также Итоном от больного атипичной пневмонией (1944 – агент Итона). Только в 1962 г. микроб был отнесён к микоплазмам и окончательно установлена его роль как возбудителя пневмонии.

Морфология:

Это мелкие (0,1 – 1,2 мкм), проходящие плеоморфные, через бактериальные фильтры микроорганизмы, которые могут образовывать коковидные, ветвящиеся, многоядерные формы, лишённые истинной клеточной стенки и не способные синтезировать её компоненты. Функции клеточной стенки выполняет трёхслойная цитоплазматическая мембрана. Грамотрицательные, как правило, неподвижные микроорганизмы. Содержат в своём составе ДНК и РНК. Геном микоплазм отличают меньшие размеры. Обычно размножаются бинарным делением, также способны к почкованию и фрагментации.

 

Культуральные свойства.                                                                                                    Это факультативные анаэробы. Микроорганизмы могут культивироваться на а) искусственных питательных средах, но прихотливы к условиям культивирования; в питательные среды (на переваре Хоттингера) добавляют нативную сыворотку, холестерин, нуклеиновые кислоты, углеводы, витамины и различные соли. Чувствительны к микроэлементному составу среды – высокое содержание Zn²⁺, Mg²⁺, Co²⁺, Fe²⁺ может ингибировать рост. Микроорганизмы растут при температуре 22 – 41 ° С (оптимальная 36 – 37 ° С), оптимум pH 6,8 – 7,4; растут медленно 5 – 7 суток. На твёрдых средах образуют характерные мелкие колонии (0,2 – 1,5 мм) с более тёмным и зернистым центром типа «яичницы глазуньи». На средах, содержащих кровь, дают α – и β – гемолиз.

На полужидких средах растут по уколу.

На жидких средах дают незначительное помутнение, некоторые штаммы дают плёнку и придонный рост.

б) для культивирования можно использовать куриные эмбрионы, гибель которых наблюдается с 3 – 5 пассажа.

в) также используют культуру клеток.

 

Биохимические свойства микоплазм разнообразны. Выделяют 2 группы:

1. «истинные» микоплазмы разлагают с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, маннозу, фруктозу, крахмал, гликоген;

2. восстанавливающие соединения тетразолия, окисляющие глумат и лактат, но не ферментирующие углеводы.

Все виды не гидролизуют мочевину и эскулин.

 

 

Антигенная структура:                                                                                                       

Сложная, имеются видовые антигены, представленные липидами, полисахаридами, белками. Для микоплазм характерен выраженный антигенный полиморфизм.

Факторы патогенности:

- экзотоксины (например, нейротоксин у M. pneumoniae)

- эндотоксины

- гемолизины

- ферменты патогенности: фосфолипаза, аминопептидаза, нейраминидаза, протеазы

- адгезины в составе поверхностных антигенов.

 

Устойчивость: мало устойчивы во внешней среде, чувствительны к высокой температуре (45 ° - 15 минут), к высушиванию, УФО, дез. растворам. Из антибиотиков чувствительны к макролидам, тетрациклинам, левомицетинам, аминогликозидам.

Устойчивы к низкой температуре, из антибиотиков – к пеннициллинам. Широко распространены в природе, в почве, в воде, организме человека и животных.

 

Роль в патологии

M. Pneumoniae – один из основных возбудителей лёгочных поражений, вызывает до 20 % всех пневмоний; в РФ в различные годы респираторный микоплазмоз занимал 4 – 6 место среди прочих возбудителей ОРЗ.

Источник инфекции – больной или носитель.

Основной путь передачи – воздушно – капельный.

Восприимчивость зависит от иммуногенетических особенностей организма. Чаще всего вспышки инфекции возникают при формировании новых коллективов (например, в воинских частях). Заболевание выше в холодный период времени.

Патогенез. Возбудитель фиксируется на мембране клеток мерцательного эпителия бронхов, нарушает их структуру (липидные компоненты мембраны микоплазм диффундируют в клеточную мембрану, а стеролы клетки поступают в мембрану микоплазм). После проникновения в клетку микоплазмы размножаются в их цитоплазме, образуя микроколонии. Цитотоксическое действие микоплазм обусловлено продукцией перекисей, разрушающих липидные мембранные комплексы, что приводит к гибели клеток.

В патологический процесс вовлекаются межальвеолярные перегородки. Возможна гематогенная диссеминация возбудителя с поражением печени, почек, центральной нервной системы. В патогенезе бронхита и пневмонии существенное значение имеют вторичная бактериальная флора, а в других органных поражениях – аутоиммунные реакции.

Иммунитет: Формируется клеточный и гуморальный иммунный ответ.

Продолжительность постинфекционного иммунитета зависит от интенсивности заболевания от 1 года до 10 лет.

Инкубационный период от 4 до 25 суток, чаще 7 – 14 дней.

Клинически различают 2 формы болезни:

                                          - острое респираторное заболевание (ОРЗ)

                                          - пневмония

Специальная профилактика - не разработана. Необходима изоляция больных из коллектива.

Для лечения используются антибиотики тетрациклинового ряда и макролиды (эритромицин, азитромицин).

 

  M. hominis входит в группу урогенитальных микоплазм, также включающую M. genitalium, M. fermentans.

 

Основной путь передачи – половой. Возможно заражение новорождённых, которые инфицируютя при прохождении родовых путей.

M. hominis преимущественно инфицирует органы мочеполовой системы, вызывая деструктивно – воспалительные процессы с выраженными микроциркуляторными нарушениями. У мужчин вызывает уретриты и простатиты, у женщин – уретриты, цервициты, воспалительные поражения тазовых органов. Особую опасность представляет урогенитальный микоплазмоз беременных, так как он может стать причиной невынашивания беременности, преждевременных родов, внутриутробного заражения плода и привести к развитию послеродового сепсиса.

 

M. fermentans. Несмотря на то, что вид был выделен ещёв 1950 г., многие из его свойств остаются неизученными.

1. Наиболее часто возбудитель выделяется от ВИЧ - инфицированных пациентов (70 %).

2. Играет роль в развитии урогенитальных заболеваний. 

3. Доказана его роль в развитии хронического пиелонефрита.

4. Возбудитель выделяют у 45 % больных ревматоидным артритом. Патогенез суставных поражений во многом связан со способностью микоплазм запускать аутоиммунные процессы, а также длительно персестировать в организме и аккомулироваться в суставных хрящах и костном мозге.

 

  Ureaplasma urealiticum

(urea – мочевина, plasma – принимающий любую форму).

Впервые выделена в 1954 г. от больного уретритом (Шепард).

 Морфология: В настоящее время выделяют 3 основных типа микроорганизмов:

- малые (мелкие) (120 – 150 нм) с гомогенной цитоплазмой и

множеством рибосом;

- средние (500 – 750 нм) с рибосомами по периферии;

- крупные, с негомогенной цитоплазмой и выраженным

нуклеоидом.

Культуральные свойства

сходны с микоплазмами. Отличается быстрым ростом при культивировании в атмосфере газовых смесей, содержащих 5 % СО₂2 и 95 % № ₂ 2, либо 5 % О2₂, 10 % СО₂ и 85 % № ₂. На жидких средах растёт скудно. Микроаэрофилы.

 

Биохимический свойства

 Уреаплазмы инертны к сахарам, каталаза – отрицательны, гидролизуют мочевину до аммиака, то есть характерна уреазная активность.

Отличительная особенность метаболизма – способность продуцировать насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты.

 

Антигенная структура сложная. В настоящее время выделяют 16 сероваров, разделённых на 2 группы (А и В). Основные антигенные детерминанты – поверхностные полипептиды.

 

Факторы патогенности. Обладает протеазной активностью, направленной

на Jg А человека. Продуцирует фосфолипазу, связанную с простагландинами эукариотических клеток. Видимо, данный фактор имеет отношение к преждевременным родам.

                                                                      

Эпидемиология:

Источник – больные лица.

Путь передачи – половой.

 

Вызывает заболевания: негонококковые уретриты (50 % у мужчин), уреаплазменные простатиты, доказана роль в развитии мочекаменной болезни, у женщин – воспалительные заболевания органов малого таза, бесплодие.

 

Патогенез:

Механизм патогенеза урогенитальных микоплазмозов до конца не выяснен. Имеются лишь отдельные сведения о взаимодействии микоплазм с клетками.

1. Персистенция уреаплазм на мембране, однако пока не установлено, являются ли они мембранными паразитами или проникают в цитоплазму.

2. Продукты жизнедеятельности уриоплазм токсичны для клеток организма и оказывают повреждающее действие на клеточную стенку. Окисление жиров в результате активности пероксидазы также способно привести к повреждению клеточной стенки.

3. Токсичной для организма может быть концентрация аммиака, образующаяся в результате расщепления мочевины.

4. Уреаплазмы утилизируют компоненты клетки хозяина, такие как холестерин и жирные кислоты.

 

Лабораторная диагностика.  

 

Особенности метаболизма уреаплазм позволяют легко дифференцировать их от прочих микоплазм по способности секретировать уреазу (метод определения уреазной активности).