Вивчення ізоелектричної точки білків

 

Для роботи необхідно: розчини: 0,01н. СН₃СООН; 0,1 н. СН₃СООН; 1 н. СН₃СООН; 0,1 н. СН₃СООNa; розчин казеїну в 0,1 н. CH₃COOONa; індикатор метилоранж; піпетка, градуйована на 10 мл; штатив з пробір-
ками.

 

Білки, які складають основу протоплазми, мають ряд властивостей, що витікають з їх специфічної хімічної природи.

Молекули білків являють собою довгі ланцюги типу полімерів, що складаються з багатьох амінокислот.

Спрощену схему структури білкової молекули можна представити таким чином:

 

Зі схеми видно, що молекула білка поряд з вуглеводневим радикалом містить значну кількість полярних гідрофільних груп: –СООН; –NH₂; =СО; =NH.

У зв’язку з цим білки мають високогідрофільні властивості. При-
сутність основної групи –NH₂ і кислотної –СООН зумовлюють амфотерні властивості білкової молекули, яка має основні властивості, коли пере-

важає вплив аміногрупи, і кислотні, коли переважає вплив

 

карбоксильної групи

У водних розчинах білки проявляють властивості слабих електролітів. В цьому випадку проходить дисоціація і основної, і кислотної групи.

В кислому середовищі дисоціація карбоксильних груп понижується водневими йонами, які присутні в надлишку. При цьому білкова молекула заряджається позитивно. Наприклад, в присутності соляної кислоти про-
ходить реакція:

В лужному середовищі внаслідок надлишку іонів ОН^– понижується дисоціація основної групи –NH₂ і білкова молекула заряджається нега-
тивно.

Отже, при певній концентрації водневих йонів (тобто при певному значенні рН середовища) кількість йонізованих основних груп і сумарний заряд частинки буде рівним нулю, тобто система буде знаходитись в ізоелектричному стані. Концентрація водневих йонів, виражена величиною водневого показника рН, при якій молекула білка знаходиться в ізоелек-
тричному стані, називається ізоелектричною точкою.

Для кожного білка існує певне значення рН, при якому він знахо-
диться в ізоелектричному стані. Для більшості білків їх ізоелектрична точка лежить в кислому середовищі при рН<7.

Це пояснюється тим, що на поверхні білкової молекули переважають кислотні групи, константа дисоціації яких набагато більша від константи дисоціації основних груп. Так як в ізоелектричній точці по всій довжині молекули розташовується однакова кількість протилежно заряджених ос-
новних і кислотних груп, то внаслідок електростатичних сил притягування молекула білка скручується в клубочок, стає більш компактною, густина її збільшується. Властивості, зв’язані з формою і зарядом макромолекули, при цьому змінюються. Так, наприклад, в ізоелектричному стані в’язкість, набухання, розчинність білків зменшуються. На пониженні розчинності білків в ізоелектричному стані ґрунтується методика визначення ізоелек-
тричної точки казеїну.

При виконанні практичної частини роботи беруть штатив на 18 про-
бірок – два ряди по 9 пробірок.

Згідно нижче приведеної таблиці в усі 18 пробірок за допомогою гра-
дуйованої піпетки заливають дистильовану воду, 0,01 н.; 0,1 н.; 1 н. роз-
чини оцтової кислоти. До пробірок першого ряду доливають по 1 мл свіжо приготовленого казеїну в 0,1 н. розчині оцтовокислого натрію. До пробірок другого ряду доливають по 1 мл 0,1 н. розчину оцтовокислого натрію і індикатор метилоранж. При цьому одержуємо буферні суміші з різними значеннями рН, причому в обох рядах пробірок склад буферних сумішей однаковий.

Розчинність казеїну залежить від рН середовища і в ізоелектричному стані вона найменша. Це спостерігається в найбільшому помутнінні розчину. Отже, значення рН в пробірці, де помутніння розчину казеїну найбільше, відповідає ізоелектричній точці казеїну.

Очевидно, перехід забарвлення метилоранжу від оранжевого до чер-
воного в пробірках другого ряду повинен співпадати з пробіркою най-
більшого помутніння в першому ряді.

 

	Номер пробірок
Дистильована вода, 10^-6м^3	8,3	7,8	8,7	8,5	8,0	7,0	5,0	1,0	7,4
0,01 н. СН3СООН, 10^-6м^3	0,7	1,2	–	–	–	–	–	–	–
0,1 н. СН3СООН, 10^-6м^3	–	–	0,3	0,5	1,0	2,0	4,0	8,0	–
1 н. СН3СООН, 10^-6м^3	–	–	–	–	–	–	–	–	1,6
Величина рН	5,2	5,6	5,3	5,0	4,7	4,4	4,1	3,8	3,5

 

Другий ряд пробірок являється контрольним. Перехід забарвлення індикатора від основного до кислого середовища повинен лежати в межах ізоелектричної точки казеїну. Для метилоранжу цей перехід лежить в межах рН = 2,7 – 4,7.

Через 5 – 10 хв. в ряді пробірок, які містять казеїн, зазначають ступінь помутніння. Відсутність помутніння позначають знаком “–”, його наяв-
ність – знаком “+”. Ступінь помутніння позначають різною кількістю знаків плюс або мінус (до трьох). В другому ряді пробірок відзначають забарвлення метилоранжу – “о”; перехід забарвлення – “п”; червоне –“ч”.

Результати роботи перевіряються керівником занять. Значення рН, що відповідає ізоелектричній точці казеїну записують.

 

 

НАБУХАННЯ ГЕЛІВ

Для роботи необхідно: желатин; 0,1 н. розчин СН₃СООН; 0,1 н. роз-
чин СН₃СООNa; штатив з пробірками; піпетка, градуйована на 10 мл.

 

Поглинання рідини студнем або гелем, що супроводжується значним збільшенням його об’єму, називається набуханням.

Процес набухання є характерною властивістю гелів у таких високомо-
лекулярних сполук, як желатина, агар-агар, каучук, що називаються елас-
тичними гелями, на противагу ненабухаючим – нееластичним гелям, до яких належать, головним чином, неорганічні гелі типу SiO₂, SnO₂, TiO₂. Подібні гелі можуть вбирати змочуючу їх рідину. Проте їх об’єм при цьому не змінюється.

Характерною рисою високомолекулярних сполук являється асиметрія форми ниткоподібних макромолекул, що мають великі розміри ланцюгів.

Властивість еластичного гелю зв’язана з пружністю ланцюгів макро-
молекул, з яких складається основа гелю. Пружність макромолекул зале-
жить від природи атомів, що входять до складу макромолекул, від харак-
теру розподілу цих атомів, від довжини ланцюга, величини міжмоле-
кулярних сил та від температури.

Процес набухання можна уявити як проникнення молекул низькомо-
лекулярного розчинника в простір між молекулами високомолекулярної сполуки. Коли вільний простір заповнюється рідиною, молекули розчин-
ника починають розширяти ланки ланцюга полімеру, утворюючи нові пус-
тоти, які знову заповнюються низькомолекулярною рідиною. У цьому ви-
падку, коли набухлий гель далі самовільно переходить в розчин при тій же температурі, проходить необмежене набухання.

Так натуральний каучук у воді набухає, а потім переходить в розчин, утворюючи розчин високомолекулярної сполуки. У даному випадку прохо-
дить розширення ланцюгів полімеру.

Гелі желатини і агар-агару при звичайній температурі набухають у воді до певної межі і в розчин не переходять. Розширення ланцюгів прохо-
дить тільки на деяких ділянках, остання частина ланцюга залишається зв’язаною між собою. У цьому випадку проходить обмежене набухання при даній температурі. Підвищення температури приводить часто до того, що обмежено набухаючі студні починають розчинятися, як це спосте-
рігається у випадку желатини. Однак, не завжди підвищення температури приводить до розчинення, наприклад, не наступає розчинення вулкані-
зованого каучука. Це пояснюється наявністю між молекулами “мостикових зв’язків”, що затруднюють перехід макромолекул в розчин. При наявності великої кількісті таких “мостикових зв’язків”, наприклад ебоніту, прос-
торова сітка полімеру стає твердою, ланцюги втрачають свою пружність і полімер втрачає свою здатність до набухання.

Початкова стадія набухання характеризується значним виділенням тепла – теплотою набухання і тиском набухання. Сума об’ємів сухого гелю і поглиненої ним рідини більша, ніж об’єм набухлого гелю. Це явище носить назву контракції. Воно спостерігається, головним чином, у гелів, що набухають у воді (желатина, агар-агар, крохмаль) і пояснюється відносно більшою густиною орієнтованих молекул зв’язаної води. Набухання в органічних розчинниках проходить без помітної контракції.

Кількість рідини, що поглинається одним грамом гелю, називається ступенем набухання.

При необмеженому набуханні кількість рідини, що поглинається, може бути дуже великою і перевищувати десятикратний об’єм взятого для набухання гелю. Процес набухання проходить з певною швидкістю, зале-
жить від природи набухаючого геля і розчинника. Набухання проходить як реакція першого порядку.

Велику групу, що мають ряд особливостей при набуханні, пред-
ставляють гелі білкових речовин у воді і водних розчинах. В цих умовах при вимірюванні ступеня набухання необхідно врахувати рН середовища.

При певній концентрації водневих йонів від макромолекули білка від-
щеплюються йони, що відповідають як кислотній, так і основній дисо-
ціації. Лише при певному значенні рН наступає такий стан, який харак-
теризується наявністю рівної кількості позитивних і негативних зарядів; білок стає електронейтральним. Такий стан називається ізоелектричним, а рН розчину, при якому цей стан наступає – ізоелектричною точкою.

Крива залежності ступеня набухання від рН має мінімум в ізо-
електричній точці. Причина впливу водневих і гідроксольних йонів на ступінь набухання полягає в тому, що в ізоелектричному стані частинки макромолекул з’єднуються в більш складні і великі комплекси. Цей процес зумовлюється деякою десольватацією ланцюгів полімерів в ізоелектрич-
ному стані.

 

Хід виконання роботи

 

Для виконання роботи в пробірках готують 6 буферних розчинів (див. табл. 1):

В градуйовані пробірки насипають по 0,1×10^–3кг сухого порошку желатини, точно відзначають об’єм сухої речовини в пробірках. Потім в кожну з пробірок вливають 5 мл одного з приготовлених розчинів з відповідним значенням рН. Через годину замірюють об’єм набухлої желатини. Ступінь набухання розраховують за формулою:

.

Таблиця 1

 

Склад розчинів	Номери пробірок
0,1 н. СН3СООН, 10^-6м^3						–
0,1 н. СН3СООNa, 10^-6м^3						–
Н2О дист., 10^-6м^3	–	–	–	–	–
Значення рН	3,8	4,4	4,7	5,0	5,6

 

Дані експерименту записують у табл. 2.

Таблиця 2

 

Склад розчину	Номери пробірок
рН буферного р-ну	3,8	4,4	4,7	5,0	5,6	7,0
Об’єм желатини до набухання, Vo, 10^-6м^3
Об’єм набухлої желатини, V, 10^-6м^3
Ступінь набухання, W,%

 

 

ХІ. БІОГЕННІ ЕЛЕМЕНТИ

 

S-Елементи та їх сполуки

З s-елементів до біометалів відносяться натрій, калій, магній та каль-
цій. Їх йони входять у склад буферних систем організму, забезпечують необхідний осмотичний тиск, беруть участь в утворенні мембранних по-
тенціалів, у передачі нервових імпульсів (Na⁺, K⁺), структуроутворенні (Мg²⁺, Ca²⁺). Такі s-елементи, як берилій, барій, мають дуже токсичні властивості. Знання фізико-хімічних основ s-елементів та їх сполук має важливе значення в діагностиці, профілактиці та лікуванні хвороб, виз-
ваних надлишком або недостачею s-елементів в організмі.