Толерантность и аутоиммунитет

Толерантность (неотвечаемость) обеспечивает отсутствие иммунного ответа на собственные анти- гены организма, т. е. иммунная система толерантна к подавляющему большинству антигенов тканей ор- ганизма (аутоантигенов). В ряде случаев наблюдают отсутствие ответа на чужеродный антиген. Состояние толерантности поддерживают разнообразные механиз- мы: Т-супрессоры, генетическая рестрикция иммун- ного ответа, уничтожение клонов Т- и В-лимфоцитов, экспрессирующих соответствующий рецепторный идиотип, ограничение антигенпредставляющих кле- ток и лимфоцитов.

Толерантность к аутоантигенам естественна. Ис- кусственная толерантность к чужеродным антигенам может быть достигнута иммунизацией по определен- ной схеме: дробным введением антигена в возрастаю-

щих количествах или однократное введение высокой дозы антигена.

Аутоиммунитет

При нарушении толерантности к собственным антигенам развиваются аутоиммунные заболевания, например, системная красная волчанка, ревматоидный артрит. Известно несколько механизмов отмены толе- рантности.

1. Повреждение клеточных мембран, например, при вирусных инфекциях.

2. Попадание в организм антигена, эпитопы ко- торого близки к эпитопам аутоантигена (мимикрирую- щие антигены).

3. Связывание чужеродных антигенов с клетками организма (см. аллергические реакции III типа).

4. Острая травма тканей может привести к осво- бождению антигенов, обычно изолированных от им- мунной системы, например, повреждение глаза может вызвать иммунную реакцию на его антигены, которые будут распознаны как чужеродные.

5. Активация иммунокомпетентных клеток мито- генами.

6. Расстройство регуляции иммунной системы (дефицит супрессорных клеток, атипичная экспрессия молекул МНС II класса).

Глава 20. ИММУНОПРЕПАРАТЫ:

ПРОИЗВОДСТВО И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА

 

Основные достижения иммунологии, связанные с практическим использованием научных результатов, направлены на профилактику и лечение инфекцион- ных и неинфекционных заболеваний. Иммунопрепара- ты, особенно вакцины, в этом отношении оказываются значительно полезнее, чем какие-либо фармацевтиче- ские продукты.

Вакцинация против оспы, бешенства, сибирской язвы, дифтерии, полиомиелита, коклюша, кори, столб- няка, анаэробной инфекции и др. привела к резкому сокращению этих заболеваний. Методы иммунологии и использование иммунопрепаратов необходимы при решении проблем переливания крови, трансплантации органов, резус-гемолитической болезни новорожден- ных, для диагностики и терапии многих заболеваний.

 

Вакцины

Вакцины — это препараты, содержащие антигены одного или нескольких возбудителей инфекционных заболеваний, и предназначенные для создания искус- ственного активного иммунитета с целью профилакти- ки и лечения соответствующего заболевания. Термин предложил Пастер в честь Дженнера, который в 1796 г. показал, что прививки коровьей оспы — вакцинация (vaccina — коровья) — эффективна для профилактики натуральной оспы. Вакцина Дженнера — гениальное эмпирическое достижение; развитие иммунологии ин- фекционных болезней как науки, основанной на зна- нии их этиологии, начинается с открытия Пастера, доказавшего возможность ослабления вирулентности возбудителей с сохранением их иммунологических свойств и создавшего вакцину против бешенства и си- бирской язвы. Это открытие послужило основой для разработки живых вакцин, содержащих микроорга- низмы с ослабленной вирулентностью (аттенуирован- ные). В настоящее время существуют разнообразные вакцинные препараты, которые будут рассмотрены ниже.

Живые вакцины готовят из аттенуированных штаммов микроорганизмов, которые получают в ос- новном путем селекции спонтанных мутантов с осла- бленной вирулентностью. Для этого микроорганизмы длительное время культивируют в неблагоприятных

для них условиях или пассируют на невосприимчи- вых животных. Например, для получения вакцинного штамма BCG (Bacillus Calmette, Guerin) Mycobacterium tuberculosis пассировали 13 лет (230 пересевов) на сре- де с желчью. Антирабическая (против бешенства) вак- цина была получена Пастером путем многократного (113 пассажей) пассирования инфекционного агента на кроликах до получения так называемого фиксиро- ванного вируса, т. е. вируса с определенным значени- ем вирулентной для кролика дозы и безопасного для человека.

Используют также вакцинные штаммы, получен- ные путем индуцированных мутаций или генетиче- ских рекомбинаций. Такие штаммы требуют длитель- ного контроля ввиду опасности реверсии к исходному вирулентному типу.

Живые вакцины используют для профилактики бактериальных (сибирская язва, туляремия, бруцел- лез, туберкулез, чума, сыпной тиф, желтая лихорад- ка) и вирусных (бешенство, полиомиелит, корь, оспа, грипп, паротит) инфекций.

Убитые вакцины получают из клеток высокоим- муногенных штаммов, инактивированных физическим (нагревание, ультрафиолетовые лучи) или химическим (фенол, этанол, ацетон, формальдегид) методами. Их используют для профилактики бактериальных (брюш- ной тиф, коклюш, холера, лептоспирозы, синегнойная инфекция) и вирусных (клещевой энцефалит, бешен- ство, грипп) инфекций. Для лечения хронических за- болеваний используют вакцины из убитых бактерий, выделенных от больного (стафилококков, гонококков, шигелл, бруцелл и др.).

Химические вакцины готовят из антигенных фрак- ций микробных клеток. Примерами бактериальных химических вакцин могут служить брюшнотифоз- ная вакцина, содержащая гликоконъюгаты клеточ- ных стенок Salmonella spp., капсульные полисахари- ды Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis и др. Вирусные химические вак- цины (против гриппа, герпеса, ящура, клещевого эн- цефалита, бешенства и др.) содержат компоненты по- верхностных структур капсида.

Преимуществом химических вакцин является от- носительно низкое содержание балластных веществ,

Адъюванты

 

Адъювант                                 Состав                                                                 Механизм действия

Таблица 42.

Неполный адъювант Фрейнда Вазелиновое масло, ланолин, эмульгатор                          Депонирование антигена, усиление фагоцитоза Полный адъювант Фрейнда  То же + BCG или мурамилдипептид                      То же + активация макрофагов и Т-лимфоцитов Алюминиевые квасцы А1(0Н)3                                                                                                 Депонирование антигена, усиление фагоцитоза Bordetella pertussis с квасцами Клетки В. pertussis, сорбированные на А1(0Н)3 То же + активация макрофагов и Т-лимфоцитов

Иммуностимуляторный комплекс (JSC0M)

Липосомы, содержащие вирусные белки                   Доставка антигена в цитозоль Т-лимфоцитов,

индукция Т-киллеров

 

высокая стабильность, малая реактогенность и воз- можность побочного действия. Отсутствие нуклеино- вых кислот исключает опасность реверсии к данному типу, потенциально существующую у живых вакцин. Недостаток таких вакцин — более низкая иммуноген- ность по сравнению с корпускулярными (содержащи- ми клетки) вакцинами из-за быстрого выведения анти- гена из организма. Для пролонгирования действия их вводят с адъювантами — веществами, усиливающими иммунный ответ (табл. 42).

Анатоксины — это обезвреженные, но сохраня- ющие иммуногенность экзотоксины возбудителей столбняка, дифтерии, анаэробной инфекции, ботулиз- ма, холеры, стафилококковый и др.

Рибосомалъные вакцины обладают высокой про- тективной активностью при сравнительно низкой токсичности и низкой типоспецифичностью, что оказывается практически ценным, т. к. позволяет по- лучить протективные вакцины широкого спектра действия (против многих сероваров одного вида или даже против нескольких видов одного рода микроор- ганизмов). Практическое применение находит рибо- сомальная поливакцина против заболеваний; вызван- ных видами Klebsiella, Streptococcus, Staphylococcus, Proteus и Haemophilus influenzae.

Генно-инженерные вакцины получают с исполь- зованием рекомбинантных клеток. Примером такой вакцины служит препарат, содержащий полипептид- ный HBs антиген вируса гепатита В. Ген, кодирующий HBs-антиген, клонирован в дрожжевых клетках, кото- рые синтезируют белок, обладающий протективной активностью. Существенным достоинством таких вак- цин является безопасность, поскольку их изготовление не требует контакта с возбудителями заболеваний.

Синтетические вакцины разрабатывают с уче- том знания структуры антигенных детерминант воз- будителя определенного заболевания, необходимых для создания иммунитета. Их достоинствами явля- ются химическая чистота и безопасность. Примером такой вакцины может служить препарат, содержащий синтетический аналог протеина клеточной мембраны малярийного плазмодия. Этот протеин обеспечивает контакт плазмодия с оболочкой эритроцита, образую- щиеся к нему антитела препятствуют проникновению возбудителя в эритроциты хозяина.

ДНК-вакцины разрабатываются на основе плаз- мид, содержащих участки вирусной ДНК. В клетках

иммунизированного животного такие плазмиды ин- дуцируют экспрессию антигенов вируса, на которые развивается иммунный ответ. Такие вакцины пока не нашли практического применения ввиду потенци- альной опасности злокачественной трансформации клеток организма с участием вакцинной ДНК.

Антиидиотипические вакцины создают на ос- нове антиидиотипических антител (АИА). Идио- тип иммуноглобулина определяется особенностями структуры его активного центра, от которых зависит его антигенная специфичность. Структура гипер- вариабельной области молекулы иммуноглобулина является отражением структуры определенной анти- генной детерминанты (например, микробного анти- гена). Иммунизация животных специфическими им- муноглобулинами (идиотипами) позволяет получить АИА, которые, отражая структуру идиотипа, являют- ся зеркальным отображением микробного антигена или “внутренним образом антигена”. Таким образом, АИА — это вакцины без антигена. Их разрабатывают против возбудителей, имеющих большое количество перекрестно реагирующих антигенов, или с трудом поддающихся культивированию (вирусы гепатита В, бешенства, грибов и др.).

Ассоциированные вакцины содержат антигены различного происхождения. Например, вакцина АКДС включает убитые клетки возбудителя коклюша, дифте- рийный и столбнячный анатоксины.

Этапы получения вакцин включают выбор штам- ма, разработку условий его хранения и культивиро- вания, подготовку посевного материала, накопление биомассы клеток в специальных биореакторах (фер- ментаторах), отделение микробных клеток от куль- туральной среды и последующую их обработку. Не- обходимым этапом является стандартизация вакцин и контроль их качества.

Бактерии культивируют на питательных средах, состав которых обеспечивает накопление достаточно- го количества биомассы с сохранением иммуногенной активности и антигенной специфичности штамма.

Вакцинные штаммы вирусов выращивают на эм- брионах птиц (кур, уток, перепелок) и на культивиру- емых клетках человека и животных. Клетки получа- ют из ткани (например, почек эмбриона человека или обезьяны) диспергированной трипсином. Суспензию клеток помещают в специальную среду, где они раз- множаются, образуя монослой на плоской поверхно-

сти сосуда (первичную культуру). Вторичная культура может быть получена путем перенесения клеток пер- вичной культуры в свежую питательную среду. Жизне- способность таких культур составляет 2-3 нед. Пере- виваемые линии клеток способны к многократному субкультивированию, они представлены различными линиями трансформированных, например, опухоле- вых клеток. Химические вакцины получают путем раз- рушения бактериальных клеток и (или) экстракцией антигенных компонентов с последующей их очисткой соответствующими физико-химическими методами. Анатоксины получают из культурального фильтрата, обезвреженного формалином (0,4% формалина, 38°C, 21-25 дней) с последующей очисткой. Рибосомы выде- ляют из клеток, разрушенных механическим способом или обработкой ультразвуком, методом ультрацентри- фугирования. Вакцинный препарат содержит рибосо- мы нескольких видов микроорганизмов и пептидогли- кан Klebsiella pneumoniae в качестве адъюванта

Контроль качества вакцинных препаратов осу- ществляют на всех стадиях их изготовления, включая контроль готовой лекарственной формы, в строгом со- ответствии с утвержденной нормативно-технической документацией. В процессе изготовления контроли- руют отсутствие посторонних микроорганизмов и со- хранение свойств (иммуногенность, токсигенность) вакцинной культуры. При контроле готовых препара- тов оценивают: растворимость и гомогенность (для сухой вакцины при добавлении растворителя); сте- рильность (методом посева на питательные среды); безвредность (пробой на животных); иммуноген- ность (вакциной иммунизируют чувствительных жи- вотных, после этого их заражают смертельной дозой возбудителя данного заболевания; процент выжив- ших животных указывает на степень иммуногенно- сти); переносимость каждой серии вакцины проводят на группе добровольцев из 5 человек, оценивают их общее состояние и местную реакцию; правильность этикетирования и упаковки.

Активность анатоксина определяют по его спо- собности реагировать со специфической антитоксиче- ской сывороткой в реакции флоккуляции.

Вирусные вакцины проверяют не только на отсут- ствие бактерий и грибов, но и посторонних вирусов, поскольку производственные культуры могут быть за- ражены разными микроорганизмами, в том числе и он- когенными вирусами. Контролируют культуры тканей и питательные среды, предназначенные для накопле- ния вирусного материала. Сбор вируса испытывают на идентичность и определяют титр вируса.

 

Иммуноглобулины

Иммуноглобулины применяют для создания искусственного пассивного иммунитета как для лечения, так и для экстренной профилактики ин-

фекционных заболеваний, особенно у лиц с иммуно- дефицитами, кроме того, их используют в диагности- ческих целях для определения антигена неизвестного происхождения.

Иммуноглобулины выделяют из сыворотки или плазмы крови доноров или иммунизированных живот- ных. Плазма — это растворимая фракция крови, не со- держащая клеток (эритроцитов, лейкоцитов); сыво- ротка — это растворимая фракция, которая образуется после свертывания крови.

Нормальные иммуноглобулины (g-глобулин, поли- валентные иммуноглобулины), содержащие антитела различной специфичности, выделяют из плазмы неим- мунизированных доноров и сыворотки плацентарной крови. Основным активным компонентом нормальных иммуноглобулинов является IgG, присутствуют также небольшие количества IgM и IgA. Каждую серию пре- парата нормальных иммуноглобулинов изготавливают из смеси плазмы, полученной от большого количе- ства доноров (не менее 5000 человек), что нивелиру- ет индивидуальные различия в содержании антител и обеспечивает стандартность иммунологической ак- тивности. Препарат содержит широкий набор анти- тел против возбудителей бактериальных и вирусных инфекций (гепатита, кори, коклюша, полиомиелита, гриппа и др.). Кровь донора собирают в стерильные емкости из полимерного материала, содержащие рас- твор антикоагулянта (5%-ный раствор натрия цитрата) для предотвращения свертывания крови. Клетки крови отделяют центрифугированием и возвращают донору, что значительно снижает возможность неблагоприят- ных для него последствий. Иммуноглобулины выде- ляют из плазмы фракционированным осаждением эта- нолом при температуре ниже 0°C для предотвращения денатурации белка, лиофильно высушивают, разводят до концентрации 10%, стерилизуют методом филь- трации и ампулируют. В связи с тем, что требования к препаратам иммуноглобулинов для внутривенного введения существенно возросли, в их производстве используют усовершенствованные технологии: ча- стичное расщепление протеолитическими фермента- ми, восстановление, алкилирование, дополнительные этапы хроматографической очистки и др.

Все препараты иммуноглобулинов контролируют на стерильность, апирогенность, содержание белка и безвредность.

Специфические иммуноглобулины выделяют из плазмы или сыворотки крови иммунизированных доноров-добровольцев или животных. Например, про- тивогриппозный иммуноглобулин — из крови доно- ров, иммунизированных живой гриппозной вакциной; антистафилококковый — из крови доноров, прошед- ших курс иммунизации стафилококковым анатокси- ном, или плацентарной крови женщин, иммунизиро- ванных в период беременности с профилактической целью.

Для получения некоторых антитоксических и про- тивовирусных иммуноглобулинов (против столбняка, ботулизма, дифтерии, анаэробной инфекции, бешен- ства, кори, энцефалита и др.) животных (лошадей, овец, коз и др.) многократно иммунизируют возрас- тающими дозами соответствующего вакцинного пре- парата. После достижения достаточного титра антител у них берут кровь и из сыворотки выделяют иммуно- глобулины по схеме, описанной выше.

Моноклональные антитела. Антитела, присут- ствующие в плазме крови, образованы многими кло- нами антителообразующих клеток и, являясь поликло- нальными, представляют собою гетерогенную группу иммуноглобулинов. Разнообразие поликлональных антител невоспроизводимо, что осложняет стандарти- зацию препаратов иммуноглобулинов, применяющих- ся для диагностики, профилактики и лечения соответ- ствующих заболеваний. Наивысшей стандартностью и специфичностью обладают моноклональные анти- тела, которые вырабатываются одним клоном клеток и поэтому идентичны по антигенной специфичности, а также по классу и типу тяжелых и легких цепей в мо- лекуле. Обычные антителообразующие клетки не спо- собны длительно сохраняться в условиях in vitro. Поэ- тому в качестве продуцентов моноклональных антител используют гибридные клетки (гибридомы), которые получают путем слияния клеток, продуцирующих антитела на определенный антиген, и миеломных кле- ток, способных к неограниченному росту in vitro. Ми- елома — род злокачественной опухоли, образующейся при разрастании плазматических клеток, синтезирую- щих строго идентичные молекулы иммуноглобулинов неизвестной специфичности. Для гибридизации ис- пользуют полученные путем мутагенеза клетки мие- ломы, имеющие маркерные признаки, позволяющие на специальных средах отделить гибридные клетки от родительских. Плазматические клетки, синтези- рующие антитела, получают из селезенки иммунизи- рованных мышей. Слияние проводят в среде с поли- этиленгликолем, отбор гибридом — на селективных средах; отбирают клетки, продуцирующие антитела нужной специфичности. Их культивируют на специ- альных средах, обеспечивающих рост клеток и про- дукцию антител.

Моноклональные антитела — уникальные по своей специфичности реагенты, используют при изучении сложных молекулярных структур, рецепто- ров и поверхностных маркеров клеток, в аффинной хроматографии для выделения и очистки веществ и клеток. Кроме того, они могут быть использованы для радиологической диагностики локализации опу- холей. Для этого получают антитела против антигена опухоли и конъюгируют их с радиоактивным изото- пом. Противоопухолевые антитела, конъюгированные с лекарственным агентом, могут быт полезными при иммунотерапии рака.

Иммуноглобулины могут быть использованы не только с целью терапии и профилактики инфекци- онных заболеваний, но и в качестве иммунокорригиру- ющих агентов.

Антилимфоцитарные иммуноглобулины блокиру- ют рецепторы цитокинов на поверхности лимфоцитов. Их применяют для снижения количества лимфоцитов при иммунном ответе на трансплантанты. Выделя- ют из сыворотки крови лошадей, иммунизированных лимфоцитами человека.

Анти-резус иммуноглобулины (фракция IgG анти- тел против резус (Rh)-антигенов эритроцитов челове- ка) используют для предотвращения гемолитической болезни новорожденных при резус-конфликте; полу- чают из плазмы или сыворотки крови резус-отрица- тельных женщин-доноров.

Моноклональные антитела против рецепторов (CD3, CD4) лимфоцитов и против ИЛ-2 предназначе- ны для избирательного подавления отдельных реакций иммунитета путем блокады рецепторов или подавле- ния функций цитокинов; их получают методами ги- бридомной технологии.