Гістохімічний варіант іфа, або імунопероксидазна реакція

Імунопероксидазна реакція аналогічна методу імунофлюоресценції, але відрізняється тим, що для постановки реакції використовуються антитіла, мічені не флюорохромом, а ферментом пероксидазою, і облік результатів проводять не під люмінісцентним мікроскопом, а під звичайним світловим.

Матеріалом для виявлення вірусних антигенів можуть бути мазки-відбитки різних органів, парафінові гістозрізи, культура клітин, мазки крові.

Імунопероксидазну реакцію ставлять і прямому та непрямому варіантах.

Прямий гістохімічний метод ІФА. При виявленні антигену з допомогою прямого імунопероксидазного методу використовують противірусні кон’югати, тобто кон’югати, отримані з антитіл, що виділені з специфічної сироватки, у поєднанні з ферментом.

Препарати з досліджуваним вірусом фіксують охолодженим до мінус 10°С ацетоном упродовж 10 хв, висушують на повітрі і наносять 0,2–0,3 мл імунопероксидазного кон’югату (антитіла до певного вірусу, мічені ферментом) у робочому розведенні, яке вказане на ампулі. Інкубують 1–2 год у вологій камері за температури 37°С, промивають 15 хв фізіологічним розчином, ополіскують дистильованою водою, висушують на повітрі. Потім наносять субстрат і через 10 хв інкубації промивають за попередньою схемою. Субстратом є діамінобензидинтетрахлорид до якого перед реакцією додають перекис водню.

Результати враховують з допомогою світлового мікроскопа. Субстрат під дією пероксидази розщеплюється, утворюючи продукт реакції блакитного кольору, який швидко переходить у коричневий. В препараті виявляють або дифузне жовто-коричневе забарвлення, або гранули коричнево-чорного кольору. В контрольних препаратах забарвлення не виявляють (рис. 18).

 

 

 

Непрямий гістохімічний метод ІФА (рис. 19). Перевагою непрямого методу є універсальність мічених антивидових імуноглобулінів, а також більша чутливість його у порівняні з прямим.

Для виявлення невідомого вірусного антигену мазки-відбитки фіксують охолодженим ацетоном протягом 10 хв. Препарати висушують і наносять специфічну до певного вірусу (імунну) сироватку (не мічену). Інкубують у вологій камері при 37°С 1–2 год. Промивають фізіологічним розчином, висушують і наносять антивидовий імунопероксидазний кон’югат (антивидова сироватка, яка містить антитіла до першої сироватки, мічена ферментом), у робочому розведенні. Інкубують при 37°С 1–6 год, промивають і висушують, як і за прямого методу; наносять кілька крапель бензидинового субстрату, інкубують упродовж 5–10 хв, знову промивають, висушують на повітрі і мікроскопують.

Якщо у препараті є вірусспецифічний антиген, то він утворює з специфічною сироваткою комплекс антиген – антитіло, до якого приєднуються антитіла антивидової сироватки, мічені ферментом. Утворюється більш складний комплекс антиген – антитіло – антивидове антитіло – фермент. Його виявляють за нанесеним субстратом, який розщеплюється ферментом і утворює жовто-коричневий продукт реакції, який виявляють під мікроскопом, як і за прямого варіанту.

 

 

Твердофазний імуноферментний аналіз. Методи твердофазного ІФА грунтуються на застосуванні антитіл фіксованих на не розчинних носіях. Твердофазними носіями можуть бути синтетичні полімери з високою сорбційною здатністю, а саме полістеролові пластинки, пробірки, нітроцелюлозні мембрани. В останній час широко використовують полістеролові мікропанелі, які мають лунки з плоским дном. Іх застосування дає змогу у короткий час досліджувати значну кількість зразків сироватки на наявність антитіл у хворих тварин чи реконвалісцентів та іншого матеріалу на наявність антигену (збудника хвороби).

Для ідентифікації антигену, з допомогою твердофазного ІФА в різних біологічних рідинах найчастіше використовують метод подвійних антитіл – «сендвіч». Лунки мікропанелей сенсибілізують специфічною до невідомого антигену сироваткою, (краще гама глобуліном, виділеним з сироватки). Для цього у лунки вносять сироватку у певному розведенні та інкубують 1 год (37°С) а потім залишають на ніч (4°С). Вранці панелі промивають тричі буферним розчином і вносять досліджуваний антиген, у контрольні лунки – наперед відомі позитивний та негативний антигени, інкубують 2 год (37°С). Промивають і вносять імуноферментний кон’югат (специфічна сироватка мічена ферментом), інкубують 1–2 год (37°С). Промивають і вносять розчин субстрату, витримують у темряві 5–20 хв за кімнатної температури. Реакцію зупиняють, додаючи розчин сірчаної кислоти. Реакцію оцінюють візуально за відмінністю у забарвленні контрольних та дослідних зразків. Позитивні зразки мають оранжево-коричневе забарвлення, негативний контроль зовсім не забарвлений або блідо-жовтий.

Наявність антитіл у сироватці крові визначається непрямим методом твердофазного ІФА показано на рис 20.

 

 

 

Облік результатів можна здійснювати з допомогою спектрофотометрії та фотоелектроколориметрії. Процес зчитування керується комп’ютером, який перераховує величину ферментативної активності у концентрацію антигену чи антитіл з швидкістю 100 зразків за хв.

Питання для самоконтролю:

1. Суть методу ІФА.

2. Суть гістохімічного методу ІФА.

3. Суть прямого варіанту гістохімічного методу ІФА.

4. Суть непрямого варіанту гістохімічного методу ІФА.

5. Суть твердофазного методу ІФА.